病毒e蛋白的原核表达纯化及初步鉴定-上海兽医研究所.doc

鸭坦布苏病毒E蛋白基因的原核表达( 姬希文1, 2，李雪松1，边延峰3，李国新1，颜丕熙1，张七斤2，李泽君1 (1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241； 2.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特0100183.天津生机集团股份有限公司，天津300384） 摘 要：本研究利用RT-PCR方法扩增鸭坦布苏病毒（Duck embusu virus，DTMUV）奉贤株（FX2010）的结构蛋白E基因，并将其克隆至原核表达载体pET32a（+），构建重组表达质粒pET32a-E。将其转化受体菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导进行表达。SDS和Western blot试验检测结果表明，E基因在大肠杆菌中得到了表达，并且可与抗DTMUV的多克隆抗体发生特异性反应。E基因的成功表达为DTMUV的诊断试剂盒、疫苗等的研制奠定基础。 关键词：鸭坦布苏病毒；E基因；克隆；表达 EXPRESSION OF E PROTEIN OF DUCK TEMBUSU VIRUS IN PROKARYOTIC CELLS JI Xi-wen1, 2，LI Xue-song 1，BIAN Yan-feng3，LI Guo-xin1，YAN Pi-xi1，ZHANG Qi-jin2，LI Ze-jun1 （1Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai200241,China; 2.College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018,China; 3.Tianjin Shengji Group Co., Ltd., Tianjin 300384, China） AbstractThe E gene of duck Tembusu virus (DTMUV) was amplified by RT-PCR and inserted into the multiple clone sites of the pET32a(+) vector. The recombinant plasmid was transformed into BL21(DE3) competent cells and the cells were induced with IPTG to express the E protein. SDSand Western Blot assays showed that he E protein was successfully expressed and kept the activity for binding the DTMUV-specific antibody. Based on E protein expressed in prokaryotic cells, it might become easy to develop diagnosis kits and vaccines for DTMUV. Key words: Duck tembusu virus; E gene; cloning; expression 自2010年春季以来，华东地区发生了以产蛋下降和死亡为主要特征的鸭病的流行，之后该病迅速传播全国多个省市，到目前为止，全国大部分主要水禽养殖地区仍然受到该病的威胁，发病率高达100%，病死率在5%~10%之间。经过病毒分离鉴定，目前已经确定引起该病的病原为鸭坦布苏病毒（Duck tembusu virus , DTMUV）[1]。DTMUV属黄病毒科黄病毒属[2]，呈球型，直径30～50 nm，核心含单股RNA，有衣壳从序列上分析，该病毒可能与其他黄病毒属的病毒一样，具有结构蛋白，即E蛋白、核蛋白和白蛋白为糖蛋白。其中，E蛋白是诱发动物机体产生抗日本乙脑病毒中和抗体的重要抗原[3] ，黄病毒属中多数病毒的E蛋白与机体宿主的免疫应答作用密切相关，能刺激机体产生中和抗体和血凝抑制抗体[4,5]，诱导机体产生持久T记忆细胞，引起保护性免疫反应。E蛋白在病毒致病过程中也起关键性作用，该蛋白上一些关键的氨基酸的替代可引起神经毒力和侵袭力丧失[3]。此外，E基因还与病毒吸附、侵入宿主细胞有关。本研究首次表达和纯化了具有生物学活性的DTMUV E蛋白，为DTMUV早期诊断试剂盒、疫苗与E蛋白结构功能研究奠定了基础。 1 材料和方法 pET32a（+）表达载体和JM109BL21(DE3)宿主菌为本试验室保存；限制性内切酶、和T4 DNA连接酶为NEB公司；pMD19-T、Ex Taq DNA聚合酶、M-MLV逆转录酶购自TaK