第九章 x-ray微区分析new9.pptVIP

X—射线微区分析技术： 是把对样品的超微结构的观察与化学元素的分析有机结合起来的一门比较新的电镜技术,它可以从超微结构水平对生物组织的结构与化学元素成分进行定位、定性、定量无损伤分析，是物理方法解决化学问题的手段之一，为研究生物学中功能变化与超微结构形态变化之间的关系提供一种新方法。 元素分析方法有三种： X射线显微化学：X射线能谱分析EDS X射线波长色散分析WDS； 电子能量损失谱分析EELS 俄歇电子谱分析 应用于生物医学、环境学、物理学和地质矿物学等领域。 应用举例 用X—射线微区分析方法检测正常组织中离子和元素的分布 对侵入到正常细胞中的有毒化学元素和颗粒物质进行鉴定 对人工引进细胞中的药物进行追踪分析； 研究药物剂量和作用时间对细胞超微结构的影响； 以及用特殊的标记方法识别分子基团和对原位生化反应的酶活性进行分析等。 分析不同状态的样品，无定形晶体元素、以不同化合键(共价键或离子键)与分子结合的元素，以及某些可溶性的自由扩散的元素等。 X—射线微区分析电镜样品制备的关键:使被分析的元素稳定在原位。 二、应用 （二）EDS工作的基本原理 当高能入射电子束激发样品中的元素产生的特征X—射线照射在硅(Si)或锂(Li)检测器上时，Si或Li原子电离，即：检测器每吸收一个X—射线光子，就打出去一个电子，产生电子—空穴对。电子—空穴对在外加的偏压作用下移动，并产生电荷脉冲信号，其与入射X射线光子的能量成正比。接着，电荷脉冲信号被前置放大器转换成电压脉冲。X-射线能量越高，产生的电荷脉冲信号越强，进而转换成的电压脉冲就越高。因此，进一步放大、整理和分类，并用计算机分析电压脉冲值，就能对电压脉冲的峰值进行识别和定量分析，最后在显象管或记录仪上显示按能量展开的X光谱，从而鉴定和计算出被分析的样品中的各种元素及其含量。 第二节 X—射线微区分析电镜样品的制备 一、制备X—射线微区分析电镜样品的特殊要求 一般要求（原则）：不十分计较样品的厚薄和软硬，但特别强调要尽量使被分析的元素与生适状态保持一致，即：元素无移位和丢失，并且对不可避免的丢失和掺入的元素的种类及其数量有比较明确的了解。与此同时，还要使样品的超微结构尽可能保存完整，以便获取被分析的元素的明确定位。 二、X—射线微区分析生物材料的类型 根据样品空间分辨率的差异，把制备微区分析样品的生物材料分为四种类型 ： (一) 块状材料 生物的硬组织：包括牙齿、骨骼、结石及木材等，对样品表面清洁，经干燥除去水分，真空中喷镀铍(对波谱分析)或碳(对能谱分析)等，喷镀层厚度约200～400?较为适宜。在进行定量分析前还须进行研磨或切片，并对标准样品及测量背底所用样品在同样条件下进行喷镀，否则将给测露结果带来误差。 生物块状软组织： (1)常规包埋法：用制备超薄切片常规方法，使样品经固定、脱水、包埋及切片等步骤，可以获得良好的形态学保存，但是化学组成受到很大破坏。因此，该方法只适用于不受这些步骤重大影响的样品。 (2)冷冻制样法：这是目前制备X射线显微分析样品最好的方法，冷冻法保存了细胞中各种可溶性物质和电解质，可以维持细胞质的化学物质在三维结构上分布的不连续性，从而进行有关的生理功能研究。 (二) 微小材料 包括微生物(病毒、细菌等)、游离的细胞和细胞器等。这类样品的特点是极微小，直径大约只有几个微米，甚至更小，质地软且含水量高。可以先离心成团块后再制备成切片，或按块状材料的方法低温冷冻断裂。也可以整装法和空气干燥法：用涂片、离心或喷雾法安装到适当支持物上，然后进行空气干燥。 (三) 无机颗粒和纤维状材料 对于无机颗粒和纤维状的材料，可以采用提取和复制的方法，如：用生理盐水从组织中洗脱，再过滤和收集；或用微量分离法从组织的基质中提取；或用塑料膜复制被测物体的自然表面或人工断裂的表面，使复制膜沾取无机颗粒和纤维后，直接进行X—射线微区分析。 (四)液体材料 指具有生理活性的液体，如体液或细胞中的液体等。可用微穿孔器获取液体材料(约几微微升)，直接测液体的浓度及其元素的组成；也可以先制成无挥发性的液晶材料，或直接把样品滴在覆盖支持膜的载网上，用蒸发法迅速干燥，再进行检测。 三、X—射线微区分析电镜样品的制备方法 (一) 常温下制备样品的方法 1．取材：与制备超薄切片取材方法一样，但特别需要迅速而彻底的清洗，防止粘液、血液、细胞外液等污染材料干扰正常的分析。最好选有机盐类的缓冲液清洗和配制固定液，如；醋酸佛罗那(Veronalacetate)、碳酸氢盐和可力丁(co