分子克隆常用的dna聚合酶.pptVIP

（二）分子克隆的基本过程 7.阳性重组子的筛选和鉴定 ⑴、根据遗传表型筛选 ⑵、应用限制性内切酶酶切分析筛选 ⑶、核酸探针筛选 ⑷、PCR筛选 ⑸、菌落原位杂交技术 ⑴、根据遗传表型筛选 Ⅰ．抗生素平板筛选 Ⅱ．?互补筛选 Ⅰ．抗生素平板筛选 大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗四环素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入载体的位点在抗药性基因之外，不导致抗药性基因的插入失活，仍能编码抗药性基因，这种含有重组子的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。 但是除阳性重组子以外．自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的基因插入载体形成的重组子均能转化细胞而能生长，故本法仅是阳性重组子的初步筛选。 Ⅱ．?互补筛选： 利用?-半乳糖苷酶基因构建的载体如pUC系列的质粒常采用?互补筛选。 ⑵、应用限制性内切酶酶切分析筛选 对于初步筛选鉴定具有重组子的菌落，应小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶(1种或2种)切割重组子释放出插入片段，对于可能存在双向插入的重组子还要内切酶消化鉴定插入方向，然后凝胶电泳检测插入片段和载体的大小。 ⑶、PCR筛选： PCR技术具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过电泳，可直接观察到产物的存在。 * Ⅱ.几种常见的质粒载体： ① pBR322 pBR322是研究得最清楚应用也最广泛的质粒，全长4363bp，由3种野生质粒成分构建而成，含有Ampr和Tetr两个抗药基因标记，一个复制起始点(ori)，复制子为Col EI。其中ori来自pM9，Ampr来自pRSF2124，Tetr来自pSCl01。在Ampr和Tetr基因中共含有8个限制性酶切位点，以供外源DNA片段的插入。其中在Ampr 基因中的单一酶切位点有PstI、PvuⅡ等；在Tetr基因中的位点有BamHI、HindⅢ、SalI等。 Ⅱ.几种常见的质粒载体： ② pUC18/pUC19 pUC系列质粒是由大肠杆菌pBR质粒和M13噬菌体改建而成的质粒载体。全长2674bp，具有氨苄青霉素抗性基因，一个复制起始点，复制子为Col EI。pUC系列质粒带有一段大肠杆菌Lac操纵子DNA片段，能编码β-半乳糖苷酶氨基端的一部分，同时与大肠杆菌的gal-基因互补。 当pUC质粒转化到gal-的宿主菌后，在含有诱导物IPTG和生色底物X-gal的培养基上形成蓝色菌落；如果外源DNA片段克隆到pUC的Lac基因区域时，造成Lac基因失活，在含有IPTG、X-gal的培养基上将生成白色菌落。  Ⅲ其他载体： M13噬菌株载体： M13噬菌体是一种丝状噬菌体，全长为6407bp，呈闭合环状并以正链单链DNA(single—stranded DNA，ssDNA)形式存在于噬菌体颗粒内。M13只感染具有F因子的雄性大肠杆菌。 M13感染大肠杆菌（ssDNA） 酶 RFDNA(双链复制型 )（可用作基因克隆 的载体 ） RFDNA拷贝数达到100～200个后 只合成单链正链DNA 包装成为成熟的噬菌体颗粒并从细菌体内溢出。 M13噬菌株载体： 特点： ①. 对外源DNA的插入无长度的限制 RF DNA作克隆。 ②. 常用载体M13mp18/M13mp19— ③.蓝白斑鉴定 （二）分子克隆的基本过程 4.目的基因的分离与制备 ⑴、人工合成基因 ⑵、应用聚合酶链反应获取目的基因 ⑴、人工合成基因： 知道目的基因的结构与核苷酸序列及其他相关的基因信息。 对于短片段(20～30bp)的合成效率较高，对于较长的基因片段的合成，必须先按照已知的DNA序列将其划分为较短的片段，由合成仪逐一合成再拼接成大片段。 ⑵、应用聚合酶链反应获取目的基因 Ⅰ.选择不同的DNA分子为模板，通过PCR扩增以获取包括外显子、内含子以及相应调控元件的完整基因片段； Ⅱ.还可以用RNA分子为模板，通过逆转录PCR扩增生成cDNA以获得大量的不含内含子及调控序列，只含有结构基因的DNA片段。 Ⅲ.通过PCR技术获取的DNA片段可直接用于后续的基因克隆、探针制备、cDNA文库的建立等众多的分子生物学研究中。 （二）分子克隆的基本过程 5.目的基因的体外重组 DNA分子的体外重组:是DNA分子之间的连接过程。这是一个DNA连接酶催化的生物化学反应 。 几种常用的DNA分子连接方法 Ⅰ．粘性末端连接法(cohesive end ligation) Ⅱ．平头末端连接法(blunt end li