第13章核酸的研究方法(王).pptVIP

核酸的研究方法 核酸制备的原则 防止核酸的降解和变性 采用温和的条件，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用。 (一) DNA的分离 （二）RNA的分离 制备RNA三点注意事项： ①所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙烤，塑料用具经过高压灭菌，不能高压灭菌的用具要用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)处理，再煮沸以除净DEPC。DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性。 ②在破碎细胞的同时加入强变性剂(如胍盐)使RNase失活。 ③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂(如RNasin)。 常用的制备RNA方法 用异硫氰酸胍／苯酚／氯仿抽提。（少量） （三）核酸含量的测定法 1.紫外分光光度法（260nm），见P507 2.定磷法 先用浓硫酸或过氯酸将有机磷水解成无机磷。在酸性条件下正磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，在还原剂存在下被还原成钼蓝（660nm），通过测定磷含量计算出核酸含量。 当RNA与盐酸共热时核糖转变为糠醛，它与甲基苯二酚(地衣酚)反应呈鲜绿色（670nm) DNA在酸性溶液中与二苯胺共热，其脱氧核糖可参与反应生成蓝色化合物，最大吸收峰在595 nm处 二、核酸的超速离心 可以测定核酸的沉降常数和分子量 三、核酸的凝胶电泳 凝胶染色 琼脂糖凝胶电泳的应用 可以确定是否存在核酸物质。 可以近似测定DNA片段的分子大小和含量 凝胶上的样品可以回收，以供进一步研究 （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳 可用于分析相对分子质量小于1000 bp的DNA片段的电泳。 比琼脂糖凝胶的分辨率高 聚丙烯酰胺中一般不含有RNase，用于RNA的分析不会分解样品 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1977年Sanger又提出了 “终止法” 共分4组，每组按一定比例加入一种2’，3’双脱氧核苷三磷酸；能随机掺入合成的DNA链，一旦掺入DNA合成即终止 ；经变性胶电泳，可从自显影图谱上直接读出DNA序列。现在测序仪采用此法。 (二)DNA的化学法测序 化学法测序由Maxam和Gilbert于1977年所发明。 基本原理：用特异的化学试剂作用于DNA分子中不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，就可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱。 G反应 用硫酸二甲酯使鸟嘌呤上的N7原子甲基化，加热引起甲基化鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在该处断裂。 G+A反应 用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂。 T+C反应 用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基。 C反应 当有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去。哌啶促使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂。 聚合酶链式反应(PCR)是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。 该反应是一指数式反应，其可在短时间内使目的片段的扩增量达到106倍，可从极微量的DNA乃至单细胞含有的DNA起始，扩增出ug级的PCR产物。 （1）DNA模板变性 （2）DNA模板与引物复性 （3）DNA链的延伸 （5）新一轮循环开始 PCR参数 变性温度与时间 退火温度与时间 延伸温度与时间 循环次数 生物学领域几乎无处不用 基因、DNA片段的克隆 人工基因构建 DNA序列测定 基因定点突变 基因型（突变）检测， SNP分析，遗传背景分析 生物物种鉴定，系统进化研究 基因表达量研究（real-time PCR） / 基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE） 医学领域应用 疾病基因检测 / 遗传病的产前诊断 致病病原体的检测 肿瘤治疗中癌基因的检测 会推广到大部分疾病治疗前的检测 DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证 其他:动、植物检疫（转基因动植物检测） DNA的化学合成（亚磷酸三酯法） DNA固相合成：固相柱子中进行 待活化核苷酸的游离基团（5‘-OH和碱基）保护封闭起来 对3‘-OH进行活化（氨基亚磷酸化合物） 核苷酸1的5‘-OH与活化的核苷酸2形成亚磷酸三酯 氧化为磷酸三酯 去除5‘-OH上的DMT(二对甲氧三苯甲基) 本章基本要求 DNA酶法测序自动化 使用4种荧光素标记的双脱氧核苷酸，毛细管电泳和激光扫描技术使测序自动化，一个泳道一次可测大约1000个核苷酸，测序已成为可以快速完成的常规技术。人类基因组测序已经完成，多态性的研究和功能基因组学已经成为研究的热点。 “DNA之父”的美国诺贝尔奖得主詹姆斯·沃森，得到世界上破译出的第一份“个人版”基因组图谱的DVD光盘礼物作为生日礼物。 人类基因