第二节 害虫抗药性监测与测定技术.pptVIP

3. 微量滴定度酶标板法 该法以96孔酶标板为载体,每孔加入昆虫匀浆液、底物、显色液 用酶标仪测定酶催化反应动力或抑制反应动力,从而确定个体抗性状况. 用该法已成功地监测出酯酶、谷胱甘肽－S－转移酶、多功能氧化酶和乙酰胆碱酶敏感性下降的抗性. 靶标酶活性测定步骤 分离提取靶标酶 加到微量滴定板上并与待测化合物、 酶反应底物及其他成份混合均匀 通过分光光度计测定吸光度值 在适宜条件下反应一段时间 酶活性降低表明待测化合物有活性 求出酶活性大小 微量滴定度酶标板法的应用 高希武等应用酶标仪动力学方法监测了3个不同抗性棉蚜(Aphis gossypii)品系. 李士根等用微量孔板法对3个现场淡色库蚊种群酯酶活力的测定表明, 3个现场种群高酯酶活力蚊虫个体频率高低与对有机磷杀虫剂的抗性程度相关。 4. 免疫学检测法及其产生的原因 抗药性的产生并不总是伴随着酶活性的增高 有时解毒酶的性质发生变化,杀虫剂的解毒代谢得到增强,但用来测定其酶活性的底物代谢能力并未增强 在这种情况下用酶活力生化检测法无法进行抗药性监测,为此研究开发了免疫学分析法. 免疫学检测法原理 免疫学检测法首先要分离纯化与抗性有关的解毒酶或靶标,以此作为抗原对动物进行免疫,制备单克隆抗体或多克隆抗体,用酶联免疫(EL ISA)专一性地检测相关抗性基因的突变酶或靶标. 此法克服了用电泳染色蛋白无法测定的困难. 有研究表明,可利用谷胱甘肽S－转移酶的单克隆抗体, 对抗DDT的淡色库蚊和冈比亚按蚊(Anopheles gam biae)进行免疫学抗性检测. 免疫学检测法的应用 已有酯酶和GST免疫学检测方面的报道 已成功地制备出抗DDT、抗有机磷和抗拟除虫菊酯的蚊虫细胞色素P450单克隆抗体. Devonshire等利用抗性桃蚜(M yzus persicae)制备了E4 酶的多克隆抗体,由于该抗体与一般酯酶不产生交叉反应,可以用正常底物监测桃蚜体内的E4 含量,从而判断个体的抗感情况以及是否存在基因扩增. Moores等采用此方法也完成了对棉蚜酯酶E4 和FE4 的检测. 除了酯酶E4 和FE4 的免疫学检测外,还有与黑腹果蝇(D rosophila m elanogaster)抗性相关的P450蛋白免疫学检测方法. 研究表明,用该法可对抗DDT与马拉硫磷的个体进行检测. （五）分子生物学检测法 害虫抗药性分子检测技术是基于对害虫抗药性机制了解的基础上建立起来的,即利用分子生物学技术检测杀虫剂作用靶标的抗性位点或解毒代谢酶基因的增强表达. 基于可操作性、实用性和经济等方面的原因,目前几乎所有的抗性检测研究都集中于靶标抗性方面, 即检测靶标基因的突变. 常用的基因突变检测技术主要包括PCR－限制性内切酶法(REN－PCR) 、微阵列(microarray) 、等位基因特异性PCR 技术( PASA－PCR ) 和单链构型多态性分析( SSCP－PCR)。 　1. PCR－限制性内切酶法 应用聚合酶反应和限制性内切酶核苷酸相结合的方法( PCR－REN) , 对SS、RS和RR个体基因产物进行分析,以抗性相关的丢失位点或突变位点作为分子标记来检测种群中抗性基因频率。 PCR－限制性内切酶法基本原理是通过对包含突变位点的碱基片段进行PCR扩增,并结合酶切位点发生变化的限制性内切酶的使用,使抗性生物个体和敏感生物个体产生不同长度大小和数目的酶切片段,由此可确定抗性的基因型。 该抗性种群的GABA第7个外显子的995部位的G突变为C,导致限制性内切酶HaeII 2个内切位点中的一个消失. 经PCR扩增并经HaeII酶切后,在聚丙烯酰胺凝胶电泳中,敏感生物个体呈现3条带而抗性生物个体有4条带,从而达到了分离鉴定的目的 . 抗环戊二烯类杀虫剂黑腹果蝇 REN－PCR是一种经济、快速的抗性突变检测技术,但只对能导致限制性内切酶酶切位点发生变化的抗性突变有检测意义,而且操作比较繁锁,因此受到很大的限制. 优缺点 2. 微阵列 由于已获得果蝇完整的基因组序列,因此根据P450的所有已知基因(90个)的编码区构建微阵列,使检测、分析这些基因在抗性和敏感品系中的表达变成可能. Daborn等应用微阵列分析了经DDT选育的抗性果蝇的所有P450基因,结果发现是一个P450的等位基因Cyp6g1的过量转录,导致了果蝇对DDT的抗药性和对新烟碱类、新型昆虫生长调节剂类杀虫剂的交互抗性. 对转Cyp6g1基因果蝇的研究表明, Cyp6g1的过量转录是果蝇对DDT及其它杀虫剂产生抗性的充分和必要条件. 优缺点 1. 由多基因家族个别成员控制的抗性(如P450家族) ,由于存在大量的候选基因,个别成员在抗性中的作用不容易区分,但用微阵列技术分析所有已知的家族成员,就能较快地鉴别出与抗性有