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大试验二淀粉酶产生菌的紫外线诱变育种
* * 大实验二 淀粉酶产生菌的紫外线诱变育种 1、掌握紫外线诱变育种的原理和方法步骤 2、了解淀粉酶活力测定方法 实验目的要求 实 验 原 理 实 验 步 骤 分三阶段进行: 诱变处理 观察诱变效应、接种、培养 ? -淀粉酶活力测定 第一部分 诱变处理 ? 1)? 制备菌(芽孢)悬液; 2)? 显微镜直接计数,调整细胞(芽孢)浓度至约108/ml/; 3)? 倒平板(牛肉膏蛋白胨;每组12套); 4)? 紫外线处理(3ml,直径6cm平皿,1~5min); 5)? 稀释(至10-5); 实验步骤 (continued) ? 实验步骤 (continued) 6) 涂平板(取后3个稀释度,每稀释度2皿,每皿加菌液100ul); 注意: 4)~6)在暗室红灯下进行 7) 培养:平板倒置装于遮光袋,放置于37℃培养48小时; 8) 采用5)~6)步同样方法稀释未经照射的菌液,并涂平板(6个),37℃培养48小时。 两天后进行第二阶段工作 实验步骤 (continued) 第二部分: 观察诱变效应、接种、摇瓶培养 ?11)接种、培养: 选取诱变组透明圈直径和菌落直径比值较大的菌落(菌株)3个,分别接种牛肉膏蛋白胨液体培养基(每株接1瓶),37℃,160rpm,培养2~3天。 9)分别计数诱变组和对照组平板上菌落数,并计算致死率; 10)观察诱变效应: 加入碘液,分别测量诱变组和对照组10~20个菌落的透明圈直径和菌落直径,并计算比值,求平均数;将诱变组和对照组数据作比较。 实验步骤 (continued) 第三部分 α-淀粉酶活力测定(部颁标准) 1、原理 α-淀粉酶能将淀粉分子键的α-1,4葡萄糖苷键任意切断成长短不一的短链糊精,以及少量麦芽糖和葡萄糖,而使淀粉对碘呈蓝紫色特异反应逐渐消失,以该颜色消失的速度计算酶的活力。 实验步骤 (continued) 2、试剂 1、原碘液 称取碘5.5g,碘化钾11g,先用少量蒸馏水使碘完全溶解后定容至250ml,贮存于棕色瓶中。 2、稀碘液 取原碘液1ml,加入碘化钾10g,用蒸馏水溶解定容至225ml,贮于棕色瓶中。 3、2%可溶性淀粉 精确称取2g可溶性淀粉(以绝干计),然后用少量蒸馏水调匀,徐徐倾于煮沸的蒸馏水中,加热煮沸至透明为止,冷却定容至100ml。(注意:此溶液需当天配置) 实验步骤 (continued) 4、0.02mol/L pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·H2O)4.52g和柠檬酸(C6H8O7·H2O)0.807g,用蒸馏水溶解定容至100ml,配好后应以酸度计或精密试纸校正pH。 5、标准终点色溶液 A液:精确称取氯化钴(CoCl·6H2O)4.02439g和重铬酸钾(K2Cr2O7)0.04878g,以蒸馏水定容至50ml。 B液:精确称取铬黑T(C20H12N2NaO7S)5mg,以蒸馏水溶解定容至50ml 使用时取A液40ml于B液50ml混合。此混合液宜冰箱保存,使用15天后需要重新配制。 实验步骤 (continued) 3、操作步骤 1) 发酵液经5000rpm离心10min,取上清,作为供试酶液。 2) 测定: A) 取2ml标准终点色溶液滴于白瓷板空穴内,作为比较颜色的标准。 *
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