由巴豆黄脉花叶病毒(CYVMV)引起的番茄叶卷曲病在印度首次被报道.docx

由巴豆黄脉花叶病毒（CYVMV）引起的番茄叶卷曲病在印度首次被报道Mohammad Sajid Khan1.Ajay Kumar Tiwari2.Sang Hye Ji1and Se Chul Chun11 Department of Bioresources and Food Science, College of Life and Environmental Sciences, Konkuk University, Seoul 143 701, Korea2 Central Lab, U P Council of Sugarcane Research, Shahjahnapur 242 001, UP, India摘要：2013年3月在印度巴赫赖奇地区马泰拉的番茄地里发现了番茄的叶卷曲病，发病率高达85%。被侵染的植株表现为叶片卷曲，同时伴随有叶片褶皱，叶脉膨大和整个植株的萎缩。用菜豆金黄花叶病毒外壳蛋白基因和DNAβ的特异性引物对病害植株样品进行PCR，其阳性扩增大约为775bp和1.35kbp。CP基因序列的核苷酸序列同源性分析和系统发育分析显示了与巴豆黄脉花叶病毒（CYVMV）很高的同源关系，同时对β卫星序列的系统发育分析也表明了与印度国内外其他菜豆金黄花叶病毒属的病毒β卫星有直接的同源关系。本文是对由巴豆黄脉花叶病毒（CYVMV）引起的番茄叶卷曲病在印度的首次报道。关键词：β卫星、核苷酸序列同源性分析（BLASTn）、外壳蛋白基因（CP gene）、巴豆黄脉花叶病毒（CYVMV）、系统发育分析、番茄 简介双生病毒科的菜豆金黄花叶病毒仅发生在热带和亚热带的农田生态系统中。番茄在印度国内外每年的种植面积约有3,900,000公顷，产量达15亿吨，是一种重要的农作物和粮食。对于巴豆黄脉花叶病毒，番茄是高度感病的，因为它们是粉虱的理想寄主，而粉虱常常带有这种病毒(Banks et al. 2001)。在印度，巴豆黄脉花叶病毒已经被发现可以侵染铁苋菜、萝卜、芜菁、木瓜、萝卜，辣椒，瓜儿豆，麻风树和杂草等农作物(Borah and Dasgupta 2012)。在试验中，用巴豆黄脉花叶病毒侵染番茄，导致了番茄叶片卷曲(Pramesh et al. 2013)。侵染番茄的菜豆金黄花叶病毒具有多样性，被侵染的番茄数量每年大量增长(Reddy et al. 2005)。在2013年3月调查了印度巴赫赖奇地区马泰拉的番茄地后，我们发现了被侵染的番茄叶片卷曲，并且发病率高达85%。该发病率是根据发病番茄植株卷曲叶子的分子特性估计的。材料和方法为了鉴定病毒和β卫星，Dellaporta等人提出了一种方法，该方法主要是从三株发病植株的枝条和一个健康无症状的植株枝条中提取全部的基因组DNA(1983)。具体的提DNA的方法：在液氮中研磨大约100mg的叶片组织样品，之后转入1ml的提取缓冲液中（100 mMTris, pH 8.0; 50 mM EDTA, pH 8.0; 500 mMNaCl; 1% βME 和33 ul 20% SDS），然后65℃水浴15min。加入1/3体积（333ul）5M的醋酸钾沉淀胞间杂质，之后用相同体积的tris饱和酚（pH 8.0）、氯仿、异戊醇（25:24:1，各自比例）再抽取两次。最后用0.6倍体积的异戊醇沉淀DNA，再用70%的乙醇洗两次，风干，用50ul的双蒸水溶解，-20℃保存。用提取的DNA做模板，加入病毒外壳蛋白基因特异性引物AV1F 5’-ATGGCGAAGCGACCAG-3’和 AV1R 5’-TTAATTTGTGACCGAATCAT-3’和β卫星特异性引物Beta01 5’-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’和Beta02 5’-GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3’进行PCR反应(Briddon et al. 2003)。25ul的反应体系：2ul的模板DNA(~50 ng/ul)、MgCl2 2 ul (25 mM/ul)、dNTPS 0.5 ul (10 mM each/ul)、两对引物各0.5ul (25 pmol/ul)、Taq DNA 聚合酶0.25ul (5 U/ul)、Taq buffer 2.5ul (10 X/ul, Solgent Co., Ltd., Seoul, South Korea),之后补双蒸水至25ul。该PCR扩增反应在全自动热循环仪（Applied Biosystem 2720, Singapore）中进行，反应条件：94℃初始变性5min；之后94℃变性5min，扩30个循环；对于CP gene primers46℃退火50s，对于betasatellite primers 50℃退火60s；72℃延伸60s