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酒精性痴呆细胞模型建立【摘要】　目的：建立Ethanol诱导脑细胞凋亡的细胞模型，探讨酒精性痴呆的发病机制。方法：以PC12细胞为模型，PC12细胞常规培养于RPMI-1640培养液中，细胞长至对数生长期，加不同浓度的Ethanol，连续培养12 h或24 h。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖；台盼蓝染色观察细胞膜完整性；荧光染料Hoechst33258和PI联染检测细胞死亡形式。结果：Ethanol抑制PC12细胞增殖并呈浓度依赖关系(P0.05)。用1×10-4 mol/L浓度的Ethanol处理细胞24 h，凋亡细胞明显增多。结论：Ethanol诱导PC12细胞凋亡模型成功建立。 【关键词】　Ethanol；　PC12细胞；　酒精性痴呆细胞模型 帕金森综合症、阿尔茨海默病等一系列老年性疾病是当前仅次于肿瘤的、严重危害老年人健康的疾病[1-2]。近年来，对这类疾病的病因、发病机制的研究越来越多。目前研究发现，慢性酒精摄入对大脑细胞产生损伤可能与神经功能退行性疾病发生发展有关，短暂的酒精接触就能产生严重的细胞毒性，引起神经元的大量死亡，长期的酒精接触能显著抑制神经元、星形胶质细胞增殖及降低细胞存活率，导致分化延缓、结构破坏[3-5]。但这方面的分子机制还有待进一步深入研究。由于神经细胞分化的特殊性，使用人原代培养神经细胞作为研究对象困难很大，笔者旨在通过建立这类疾病的细胞模型，为研究该类疾病机制建立简单可行的研究基础。 1　材料与方法 1.1　材料 1.1.1　细胞株　大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)，细胞株购自中国科学院上海细胞所，培养于含10%灭活胎牛血清、5%马血清和青霉素(100 IU/ml)及链霉素(100 μg/ml)的1640培养基(Gibco公司)中，置于5%CO2、37 ℃恒温密闭式培养箱内培养，取对数生长期的细胞用于实验。 1.1.2　主要试剂　RPMI1640购自GIBCO公司；MTT购自PROMEGO公司，100 mg溶于20 ml PBS过滤后避光保存；DMSO购自Solarbi，Hoechst33258购自Sigma公司；Propidium Iodide，PI购自美国Promego公司。Ethanol等其他所用试剂除特别注明外均为国产分析纯。 1.2　方法 1.2.1　实验分组　取对数生长的PC12细胞分4组：(1)空白对照组：只加完全培养液；(2)低浓度药物组：加入1×10-5 mol/L乙醇；(3)中浓度药物组：加入1×10-4 mol/L乙醇；(4)高浓度药物组：加入1×10-3 mol/L乙醇。 1.2.2　MTT法检测乙醇对细胞增殖的影响　对数生长期PC12细胞按1×104浓度平均接种到96孔板，24 h后更换细胞培养液，分别加入含不同浓度ethanol的培养液，于培养箱内继续培养24 h。每孔中加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，37 ℃培养4 h。采用扣板法弃去所有溶液，加入200 μl DMSO溶液，于蜗旋振荡器上震荡10 min，置于全自动酶标仪检测在OD570处的特异性吸收值。计算细胞抑制率：抑制率=(1-实验组A值/空白对照组A值)×100%。 1.2.3　活细胞染色判定细胞生存状态　将对数生长期PC12细胞接种在多聚赖氨酸包被的盖玻片上。培养24 h后更换细胞培养液，加入含不同浓度ethanol培养液继续培养24 h。4%多聚甲醛4 ℃固定5 min，PBS洗涤3次，加入DNA特异结合的荧光染料Hoechst 33258(10 μg/ml)和PI(10 μg/ml)，37 ℃染色15 min后，紫外光激发，观察死亡细胞(PI阳性)、活细胞(hoechst33258阳性、PI阴性)形态。在OLYMPUS-BX51荧光显微镜下观察细胞状态：早期凋亡细胞(细胞核凝集，亮蓝色，PI染色阴性)，中后期凋亡细胞(核呈红色，PI阳性)，后期凋亡细胞(核呈碎块状，PI阳性)，正常肿瘤细胞(细胞核呈均匀蓝色，hoechst33258阳性)。实验经3次以上重复。 1.3　统计学处理　应用SPSS 12.0软件包处理，计量资料以(x±s)表示，行单因素方差分析及两两均数比较t检验，P0.05为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　不同浓度ethanol对PC12增殖的影响　对数生长期PC12细胞经不同浓度的ethanol作用24 h，MTT法检测细胞生长抑制情况。随着ethanol浓度的增加，PC12细胞生长受到显著抑制，抑制率与药物浓度正相关，呈剂量依赖关系。见图1。 图1　 不同浓度ethanol对PC12细胞增殖抑制作用(不同浓度ethanol作用PC12细胞24 h，对PC12细胞有明显的增殖抑制作用，而且