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western blot（Western blot） －SDS PAGE和Western blot 一。溶液配制： 1。SDS相关溶液 （1）。电极缓冲液： Tris：6g 甘氨酸：28.8g （10%）：10ml SDS 加1000毫升水pH值：8.3 （2）。分离胶缓冲：100ml： Tris：36.6g 1N HCl：（约48ml）：pH值：8.9 加水至：100ml （3）。浓缩胶缓冲：100ml： Tris：5.98g 1N HCl：（约48ml）：pH： 加水至：100ml （4）。凝胶贮存液：100ml： ACR：30g Bis：0.8g 加水至：100ml （5）。4xloading缓冲： 组：20%利多卡因2ml SDS：8% 0.8g 甘油：40% 4ml 溴酚蓝：0.4% 0.04g 三氯（pH6.8）240mm 2.5ml（浓缩胶缓冲） 加1.5ml H2O 总：10ml （6）染色液（快速染色配方，染色1小时 0.1%考马斯亮蓝、10%乙酸、45%甲醇 考马斯蓝R-250 1g 甲醇450ml 水450ml 冰醋酸100ml （7）。脱色液：1000ml 冰醋酸：75ml 甲醇：50ml 水：875ml 2、Western blot相关溶液 （1）转移缓冲液：称取2.9g甘氨酸，5.8g三碱，0.37 SDS，200ml甲醇，加去离子水至1000ml，如果蛋白分子量小可不加SDS。 （2）PBS－T：8.0g NaCl，KCl 0.2g，磷酸二氢钾0.2g，Na2HPO4？12H2O 2.9g，溶于800ml去离子水中，用盐酸调pH值为7.4，定溶至1000ml，0.05%加Tween20。 （3）：5%封闭液脱脂奶溶于PBS中 （4）：0.2%氨基黑染液氨基黑溶于7%乙酸中。 （5）：30%氨基黑脱色液甲醇，10%冰醋酸溶液。 3。细胞裂解液 （1）缓冲区：25 mM Tris-HCl pH 7.5 50毫米氯化钾 2毫米氯化镁 1毫米EDTA 5毫米的二硫苏糖醇（DTT） （2）细胞核裂解液 Buffer NE： 25 mM Tris-HCl pH 7.5 0.42 M NaCl 1.5毫米氯化镁 0.5毫米EDTA 1毫米的二硫苏糖醇（DTT） 25%蔗糖 0.2% SDS（免疫沉淀不加） 裂解细胞前加入蛋白酶抑制剂至终浓度为100 mg？L-1 PMSF，1 mg？1毫升抑肽酶，2毫克？L-1肽酶 二。步骤 SDS电泳 按照胶配置方法配制不同浓度页胶，电泳置染料抵达分离胶底部，断开电源。取下凝胶， Western blot 1。电泳结束后， Cut with to transfer protein lanes of the gel, the lower right corner as a marker to determine the direction and the positive and negative. 2. cut 1 pieces of NC film with the same gel size (not greater than the gel). Make a mark at the lower right corner and soak in the transfer buffer for about 5 minutes. 3. cut 8 pieces of Xinhua 1 filter paper and make a mark at the bottom right. The size is slightly the same as that of the gel (no more than gel). 4. will cut a good filter in transfer soaking buffer, as anode to cathode (from the bottom) order of installation and transfer device: flat bottom electrode, placing 4 soaked filter paper on the bottom electrode, precise alignment, the NC film is placed on the filter paper, remove air bubbles. Transfer the SDSelectrophoretic gel to the transferred buffer, rinse it, place it on the NC film, and extrude all bubbles with a glass rod. Pl