细胞原代培养.docVIP

细胞原代培养 【实验目的】 理解细胞原代培养原理 熟悉细胞原代培养方法与过程 了解细胞原代培养的应用 独立进行细胞原代培养操作 【实验原理】 原代培养实验原理 细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，即组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长，代谢，繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。 原代培养的方法有： 组织块法:在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 酶消化法: 将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的0.125%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养 。 【实验仪器、材料、试剂及用品】 1.仪器：荧光显微镜，CO2培养箱 2.材料：孕鼠 3.试剂：(1) 培养液：为DMEM，添加10％新生牛血清(NBS)、青霉素100 u／ ml 、链霉素100ug／ml。(2)消化液：为0.125％胰蛋白酶—0.02％EDTA混合消化液。 4.用品：镊子，剪刀，培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯、小指管。 【实验步骤】 (一)小鼠胚胎的准备: 取怀孕16～18d的母鼠，断颈处死，置于75%的酒精中。 无菌条件下暴露子宫。 用镊子提起近子宫颈端，分离子宫系膜， 剪断子宫角。 取出整个子宫，置于盛有PBS或未添加血清的DMEM培养液的培养皿内。用PBS洗涤3次，弃除表面残余血迹。 沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS或未添加血清的DMEM培养液的培养皿内。充分洗涤，清洗表面。 用小镊子撕破胎膜，取出胎鼠，弃除胎膜。用PBS洗涤3次。 去除胚胎头部、内脏和四肢。将躯干部置于另一盛有PBS或未添加血清的DMEM培养液的培养皿内。用PBS至少洗涤3次，充分弃除红细胞。 (二)小鼠胚胎成纤维细胞的培养： 1.用无菌眼科小剪刀或剃须刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内。 2.室温下静置1min。弃上层液，留下胚胎组织碎块。 3.添加胎牛血清接种到培养瓶内。每5-30个鼠胚的组织块可使用1个100ml的培养瓶。静置5min后，倒置加入适量培养液，并倒置在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。 4.2-3小时后,将培养瓶翻转过来，使培养液覆盖植块。继续在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养。 5.培养开始的前两天不要晃动培养瓶。第三天见植块附着在培养瓶壁，周围生长出细胞。补充培养液，继续培养，每天倒置在显微镜下观察。过4天后在倒置显微镜下观察拍片。 【实验结果】 图二 小鼠胚胎成纤维细胞原代培养 【结果分析】 从照片来看，细胞原代培养较成功，大部分细胞活性较好，呈梭形附着与瓶壁上，密度适中，死细胞较少。可继续进行后续传代培养。 【注意事项】 1.原代培养材料的选择,尽量选取胚胎或幼小的生物体组织或者繁殖能力较强的组织，如肿瘤组织等。 2.要注意无菌操作。其要求应高于外科手术。 3.运用消化法时胰酶温度应小于370C，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。因为此过程不像消化培养细胞时的1—10分钟，而是至少20分钟，先消化下来的细胞在此胰酶消化液中可存活10分钟以上。如果胰酶作用过强，则这些细胞膜易被损伤而不易生存。 4.如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时再使之与培养液接触。翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮起来。如果组织块没有粘壁，则细胞不易生长，既使生长也因没有贴在瓶壁上，而无法收集到。 【思考题】 一、如何提高原代细胞培养的成功率？ 答： 在选择材料的时候一定要注意选取比较健康的小鼠。在处理胚胎的时候要干净利落。不要把胳膊等部位的细胞混进去了。 操作一定要无菌，不能污染。在剪碎细胞的时候，一定要注意尽量剪得碎一点。 .运用消化法时胰酶温度应小于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半 如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时再使之与培养液接触。