3酶分离纯化.pptVIP

第四章 酶的提取与分离纯化;酶的纯化过程与一般蛋白纯化过程相比有本身独有的特点:一是特定的一种酶在细胞中含量很少;二是酶可通过测定活力的方法加以跟踪.;第一节 细胞破碎（link)第二节 酶的提取 (link) 第三节 沉淀分离(link) 第四节 离心分离 第五节 过滤与膜分离 第六节 层析分离 第七节 电泳分离 第八节萃取分离 第九节 酶的结晶 第十节 浓缩与干燥;第一节 细胞破碎;细胞的破碎方法： 一、机械破碎法 二、物理破碎法 三、化学破碎法 四、酶学破碎法 ;原理：机械运动所产生的剪力作用于细胞 1 机械捣碎法：捣碎机，10000rpm，实验、生产规模 均可 2 研磨法：研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器械， 效率较低 3 匀浆法：匀浆器，用于颗粒细小的组织细胞 破碎程度高。对酶破碎少，难于工业化。;包括: 1、温度差破碎法; 2、压力差破碎法; 3、超声波破碎法;;1、温度差破碎法;2、压力差破碎法;频率 10~20KHz，功率100~150W，温度0~10oC， pH4~7，时间3~10min，间隔多次;对数生长期细胞，细胞浓度和溶液粘度不宜太高。暴露于9～10kHz声波或10～500kHz超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便.且效果也好，但一次处理量较小;应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在;处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。;三、化学破碎法;表面活性剂(溶于液体后，具有使表面张力显著降低作用的物质)和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。 离子型表面活性剂会使酶的结构破坏，不用之。 常用的非离子型表面活性剂为： Triton(辛基酚聚氧乙烯醚,聚乙二醇辛基苯基醚 ); Tween(聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯,吐温,聚氧乙烯山梨醇酐三硬脂酸酯 ) 用凝胶层析等方法除去表面活性剂，以便酶的进一步纯化。对膜结合酶的提取特别有效。;四、酶学破碎法;1g菌体加1～10mg溶菌酶， pH6.2～7.01h内完全溶菌。于生理食盐水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌，虽失去细胞膜，但原形质没有脱出。 蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。 革兰氏阳性菌：细胞结构和形状依赖于壁上的肽多糖，溶菌酶能专一性作用于肽多糖的β-1，4-糖苷键。 革兰氏阴性菌：除了溶菌酶外，另加EDTA才有效。 酵母：其细胞壁的主要成分是β-1，3-葡聚糖，需加β-葡聚糖酶； 霉菌：其细胞壁含有几丁质，可用几丁质酶； 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。;将待破碎的鲜材料在一定pH和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。 自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。于温室30℃左右较早溶化。 自体融解过程中PH显著变化，随时要调节pH。 自溶温度选在0～4℃，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。 适宜的自溶条件：温度、pH值、离子强度等 加入噬菌体感染细胞 电离辐谢;第二节 酶的提取;盐溶现象: 在一定浓度的盐存在下,酶的溶解度增加. 盐析现象: 当盐的浓度太高,蛋白的浓度反而下降,从溶液中析出.一般采用稀盐溶液，0.02~0.05mol/L。 等渗盐溶液尤以0.02～0.05mol/L磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。0.15mol/L氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L碳酸氢钠液提取等。;蛋白质提取液的pH值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等电点两侧。 如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果。;如细胞色素C属碱性蛋白质，常用稀酸提取； 肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，用稀碱提取； 某些蛋白质或酶与其分物质结合常以离子键形式存在，选择pH3～6范围对于分离提取是有利的。;与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶需用有机溶剂提取。 有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。一些和脂结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐或稀碱液中，可用不同比例的有机溶剂提取。 例: 从一些粒线体（Mitochondria)及微粒体（Microsome)等含多量脂质物质中提取蛋白质时，采用Morton的丁醇法效果较好。 因丁醇使蛋白质的变性较少，亲脂性强，易透入细胞内部，与水也能溶解10%，因此具有脂质与水之间的表面活性作用，可占据蛋白质与脂质的结合点，也阻碍蛋白质与脂质的再结合，使蛋白质在水中溶解能力大大增加。 ;二、影响酶提取的主要因素;2、pH值 为了防止酶