试验2纸色谱分离几种氨基酸.DOC

实验五 纸色谱和柱色谱 [实验目的] 1. 掌握纸色谱的基本原理及其用途。 2. 学习柱色谱的基本原理及其用途，熟练掌握柱色谱的操作方法 [实验原理] 一、 纸色谱 纸色谱是以滤纸作为载体，让样品溶液在纸上展开达到分离的目的。纸色谱法的原理比较复杂，主要是分配过程，纸色谱的溶剂是由有机溶剂和水组成的，在滤纸的一定部位点上样品，当有机相沿滤纸流动经过原点时，即在滤纸上的水与流动相间连续发生多次分配，结果在流动相中具有较大溶解度的物质随溶剂移动的速度较快，而在水中溶解度较大的物质随溶剂移动的速度较慢，这样便能把混合物分开。 二、柱色谱 吸附柱色谱通常是在下端带有活塞的玻璃管（色谱柱）中填入固体吸附剂，从柱顶加入混合物样品溶液，各组分被吸附在柱的上端，然后连续加入洗脱剂，样品在吸附剂上反复地进行着吸附－解吸－再吸附－再解吸的过程，吸附时则停顿，解吸时则随着洗脱剂向下移动。由于各组分对于吸附剂的作用能力不同，向下移动的速度也不同，作用能力强的向下移动的慢，作用能力弱的移动的快，随着洗脱过程的不断进行，各组分便得到了分离。 [实验装置] 图1 纸色谱 图2 纸色谱滤纸条点样 图3柱色谱装置 1.层析缸2.滤纸3.展开剂 [课前预习] 柱色谱 、纸色谱 [实验步骤] 一、纸色谱分离几种氨基酸 本实验以饱和水的正丁醇溶液作展开剂，通过实验测出丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸的Rf值，并分析测定未知试样的成分或组成。 1．滤纸的选择 滤纸的质量应厚薄均匀，能吸附一定量的水，可用新华1号，切成纸条，大小可自由选择，一般为3×20 cm，5×30 cm，8×50 cm等。滤纸用前应经过试验，观察分离效果，色点边界清晰为好。 2．配置展开剂 正丁醇：水：乙酸=4∶5∶1（体积比）按他们用量比例，先将正丁醇与水在分液漏斗中一起振摇10～15分钟，然后加乙酸再振荡。静置分层，下层弃去，上层作为展开剂，将展开剂倒入层析缸内盖上盖，放置0.5小时，使缸内形成饱和蒸气。 3．显色剂 95份正丁醇及5份（体积比）2 mol?L-1的CH3COOH混合作为溶剂，加入茚三酮配成0.1 %的溶液。 4．取5×30 cm的滤纸一张，在距离一端2 cm处用铅笔轻划一直线，在直线上用铅笔轻轻地划4个“×”号，并注上号码1，2，3……，在各点上用毛细管（管口要齐）分别点上谷氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸已知样，在第四点上，点上未知样，每加一点样品就用吹风机以温热的风吹干，每个样品点三次。 将层析液倒在一培养皿中（约1～1.5 cm深），先将点好样的滤纸上端夹在支架上，下端放在皿的外边（不要与溶剂接触），盖上层析缸盖。10分钟后，滤纸吸附蒸汽达到平衡，用夹子将滤纸下端迅速放入皿中，溶液因毛细现象逐渐向上渗透扩散，当前沿距样15 cm左右处停止展析，取出滤纸，用铅笔划出溶剂前沿线。晾干，喷上显色剂到刚好润湿滤纸，用吹风机吹干，并在85～90 ℃烘干，则显出紫红色斑点。 （1）计算已知样和未知样各点的Rf值。 （2）根据已知样和未知样各点的Rf值。做定性分析。 二、柱色谱法分离偶氮苯与邻-硝基苯胺 本实验是以小型层析柱分离偶氮苯与邻-硝基苯胺的少量混合溶液。 所用主要仪器及药品为： 层析柱：长25 cm，内径1 cm 吸附剂：市售中性氧化铝（100目，Ⅱ～Ⅲ级）10 g。 淋洗剂：① 1,2-二氯乙烷与环己烷等体积混合液80～100 mL，② 95 %乙醇（备用）。 待分离混合样：1 %偶氮苯的1,2-二氯乙烷溶液与1 %邻-硝基苯胺的1,2-二氯乙烷溶液的等体积混合液约1 mL。 （1）湿法装柱：将洗净晾干的层析柱中注入约为柱容积1/4的淋洗剂。将淋湿的一小团脱脂棉推入柱底狭窄部位（勿挤压太紧），上面加盖一张直径略小于柱内径的滤纸片。将10 g中性氧化铝在小烧杯中用淋洗剂调成悬浊状。打开柱下活塞调节流速约1滴/秒，将制成的悬浊液在自柱顶注入，可敲击柱身以使吸附剂沉积均匀。在此过程中应始终保持吸附剂沉积层上面有一段液柱。吸附剂加完后关闭活塞，将一块滤纸片盖在吸附剂沉积面上。 （2）加样：打开柱下活塞放出柱中液体，待液面降至滤纸片时关闭活塞，将1 mL待分离的混合样液沿柱内壁加入。打开活塞，待样液液面至滤纸片时关闭活塞。用干净滴管吸取淋洗剂约0.3 mL沿加样处冲洗柱内壁。再打开活塞将液面降至滤纸处。依上法重复操作直至柱壁和顶部的淋洗剂均无颜色。 （3）淋洗和接收：加入大量淋洗剂，打开柱下活塞，控制流出速度为1滴/ 秒。观察柱中色带下行情况。随着色带向下行进逐渐分为两个色带，下方的为橙红或橙黄色，上方为亮黄或微带草绿色，中间为空白带。当前一色带到达柱底时更换接收瓶接收（在此之前接收的无色淋洗剂可重复使用）。当第一色带接收完