国家标准草莓潜隐环斑病毒检疫鉴定方法编制说明.DOCVIP

《凤仙花坏死斑病毒检疫鉴定方法》 1. 目的和意义 凤仙花坏死斑病毒（Impatiens necrotic spot virus, INSV）是布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）内发现的第二种病毒。 INSV可侵染50个科300多种植物，其中包括观赏植物39个属、蔬菜6个属，包括马蹄莲、菊花、唐菖蒲、黄瓜、辣椒和莴苣等常见花卉和重要经济作物。INSV引起的症状多样，随寄主和侵染时期不同而变化，主要表现为矮化、环斑、叶片或茎部的褐色至紫色的斑点、茎部变褐（溃疡）、碎色花，甚至植株死亡。自1987年美国的凤仙花上首次发现INSV以来，现已在比利时、法国、德国、意大利、荷兰、波兰、葡萄牙、西班牙、英国、加拿大、哥伦比亚、墨西哥、美国、哥斯达黎加和以色列等多个国家发生。该病毒引起的病害已造成欧洲和美国的花卉种植业的巨大损失。由于西花蓟马的传播，欧洲很多国家多种温室观赏植物的种植受到严重打击，甚至造成大岩桐的绝收。INSV对欧洲蔬菜的危害集中在保护地的生产，仅在意大利有少数危害室外种植莴苣等作物的报道。在美国也有越来越多的温室观赏植物受到INSV的威胁。现在有效的防治措施主要是针对传播介体的控制和无毒种苗的种植。INSV分布广泛，危害严重已在国外引起重视，被欧洲及地中海植物保护组织（European and Mediterranean Plant Protection Organization，EPPO）鉴于寄主范围广、传播途径多、适生性强，进口植物种苗携带该病毒的风险性很大但我国还未有相应的检测标准，迫切需要一套规范标准的检测方法，以便实施有效的检疫以防止随种苗的贸易传入我国引起农业生产的巨大损失。在大量和深入研究的基础上建立方法，以成熟可靠规范化方法为依据起草标准，制定的标准适用于可能携带的无性繁殖材料、组培苗的检测 本标准是由国家 本课题小组成员通过多种方式和渠道收集到大量的有关病毒方法相关资料，对为害特性、传播规律方法等最新研究进展等有了全面深入的了解为标准的制定打下了良好的基础。 3. 标准主要 3.1 范围 本标准规定了的基本原则和方法。 本标准适用于可能携带的无性繁殖材料、组培苗苗木的检测。 3.的方法 的稳定、准确、。3.3 检测结果评定 样品经RT-PCR检测为阴性，证明样品不携带。样品经检测为阳性如果RT-PCR结果阳性，且序列测定结果为目的序列或者经实时荧光RT-PCR检测为阳性时，可判定样品携带。3.6 样品保存与复核 含有的所有样品、照片和实验记录都应妥善保存，以备复核、谈判和仲裁。 平均OD值（405nm） P/Na 样品编号 平均OD值（405nm） P/Na 1 3.3 27.731 7 0.172 1.445 2 3.3 27.731 8 0.150 1.261 3 2.396 20.134 9 3.3 27.731 4 2.425 20.378 10 3.3 27.731 5 1.547 13.000 11 2.354 19.782 6 3.3 27.731 12 2.973 24.983 注：a，用红色标示阳性结果。 巢式RT-PCR检测 对上述10个样品进行巢式RT-PCR检测，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示除7和8号样品外，其它样品均能扩增出大小约338 bp的目的条带，因此除7和8号样品外均为阳性，与DAS-ELISA和检测结果一致。图1为其中1-5号样品的巢式RT-PCR产物电泳图，均扩增得出目的条带。 图1 1-5号兰花样品巢式RT-PCR产物电泳图图 实时荧光RT-PCR检测 对1、2、4和5号样品进行实时荧光RT-PCR检测，结果表明CT值均小于30，证明这4个样品为阳性。图2中可看到这4个样品均得到一条明显的扩增曲线，说明样品中有INSV目的片断存在。 图2 实时荧光RT-PCR检测兰花样品扩增曲线图 主要参考文献 A C, de Haan P, Kitajima E W, et al. Characterization of a distinct isolate of tomato spotted wilt virus (TSWV) from Impatiens sp. in the Netherlands[J]. J. Phytopathology, 1992, 134: 133-151. 3) 汪鑫, 郭京泽. 凤仙花坏死斑病毒及其防治[J]. 植物检疫, 2004, 18(2): 86-87. 4) Law M D, Moyer J W. A tomato spotted wilt-like virus with a serologically distinct N protein[J]. J. Ge