第5章 基因工程基本流程-获取目的基因幻灯片.pptVIP

制备原则：DNA片段之间存在部分重叠、大小均一 （1）染色体DNA大片段的制备 超声波 机械搅拌 ① 物理切割法-平末端 内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。 ② 酶切法-粘性末端 文库构建策略 * ②常用载体 （2）构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。 载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。 ①对载体的要求 质粒：cDNA文库载体 ?载体系列： 容量为 24 kb cosmid载体： 容量为 50 kb YAC： 容量为 1 Mb BAC: 容量为 300 kb 基因组文库载体 * （3）构建基因文库的受体选用 大多数情况下，基因文库的受体是大肠杆菌 优点：繁殖迅速，易于保存，克隆操作简 便，转化效率高 少数情况下，如为了使目的基因高效表达，也可选用动植物细胞 * 在基因组文库的构建过程中， 严禁外源DNA片段之间的连接。为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合： 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端 * 基因组文库重组克隆排序 染色体步移/走读（chromosome walking） 基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.2 - 2.0 kb范围内.分别以上述亚克隆DNA片段为探针，杂交同一基因文库，阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体DNA的端点。 * * 基因文库的筛选 文库筛选根据有关目的基因的背景知识： 目的基因的部分或全部碱基序列已知 目的基因编码产物的结构或功能已知 目的基因与某些生物表型的相关性已知 * 文库的保存 主要以菌落及噬菌斑的形式进行保存 * * * * * 在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下便可制备到两种不同mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA种的总mRNA群体，其二是不含有目的基因mRNA种的总mRNA群体。通过这两种总mRNA（或是它们的cDNA拷贝）为探针的平行杂交，对由表达目的的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点；而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落。 差别杂交 * * 局限性 差别杂交的灵敏度比较低，特别是对于那些低丰度的mRNA而言，这个缺点就显得更加突出 差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或克隆片段，十分耗费时间和金钱 * 原理： 羟基磷灰石柱 结合DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。 （Hydroxylapatite column） 扣除杂交 * 从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。 将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。 不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。 用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。 * A A A组织 B组织 总mRNA（A） 总mRNA（B） 含蛋白A的mRNA 不含蛋白A的mRNA 总cDNA第一链 A 杂交 内含蛋白A 的cDNA 羟磷灰石柱 过柱 吸收RNA-DNA 单链滤过 羟磷灰石柱 B A * PCR扩增法 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是： 已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。 The National Center for Biotechnology Information/NCBI?: /genbank European Bioinformatics Institute/EMBL-EBI: http://www.ebi.ac.uk/ DNA Data Bank of Japan/DDBJ: http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-e.html * 1. 直接从基因组中扩增 （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增 适合扩增原核生物基因。 * 原核基因组部分 原核细胞 提取基因组DNA PCR扩增 *