蛋白质分离纯化幻灯片.ppt

4.1 亲和色谱 4.2 亲和洗提 （4）以特异性结合位置为依据 亲和层析 原理：酶的底物或竞争性抑制剂通过共价键与惰性载体（如琼脂糖）相连接，形成亲和载体。当混合物通过亲和载体时，酶由于与底物或竞争性抑制剂之间有非共价键特异性相互作用而保留在柱子上，其他酶和杂蛋白被洗出柱子。然后加入底物进行竞争，或改变pH或离子强度使结合的酶解吸，从而达到分离的目的。 亲和层析的基本特点 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点： 纯化过程简单、迅速，且分离效率高 特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子 纯化倍数大，产物纯度高 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件 因此应用范围受到一定的限制 具有特异性亲和作用的生物分子 抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA) 酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体 维生素与其特异性结合蛋白 糖蛋白与其相应的植物凝集素 亲和层析载体的选择 具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过 具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速 具有惰性，尽量减少非专一性吸附 具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合偶联 在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性 常用的亲和层析载体 纤维素 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 其它新型载体 亲和层析配基的选择 纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力 但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性 配基必须具有适当的化学基团，用于和载体相连，但这种基团不参与配基与生物分子之间特异结合，还不能影响配基与生物分子之间的亲和力 非专一性洗脱 通常采用改变pH、离子强度、离子种类或者温度等使固定配基与生物大分子结合的亲和力降低，但使用较广泛的是改变溶液的离子强度。 非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低 专一性洗脱 使用特异的配基作为洗脱剂 使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗脱目标产物 3、原核细菌表达的重组蛋白产物的质量检测项目与方法 检测项目 检测方法 产品是否含内毒素 家兔热原法 蛋白质是否变异 肽谱、HPLC、等电聚焦、毛细管电泳 甲硫氨酸是否被甲酰化 肽谱、质谱、HPLC、Edman分析 蛋白质是否变性、聚合、脱氨基 SDS、凝胶层析、等电聚焦、质 配体是否脱落 SDS、免疫分析 氨基酸是否发生取代 氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳 产品是否被细菌、病毒、支原体等污染 微生物学检测 谱、HPLC、毛细管电泳、Edman分析 蛋白质的分离纯化 ①产物大多处于细胞内, 提取前需将细胞破碎, 增加了很多困难; ②产物浓度较低、杂质多, 而最后成品要求达到的纯度高, 故提取较困难, 且收率低, 常需好几步操作并需采用高分辨力的精制方法; ③产物都是大分子蛋白质, 通常不稳定, 遇热、极端pH、有机溶剂和剪切力等易引起失活。 重组蛋白的分离纯化过程特点 1 蛋白质的分离方法 （1）以大小或质量为依据： 离心（300000g)、凝胶过滤（Sephadex交联葡聚糖、Bio-Gel交联聚丙烯酰胺）、透析、超过滤 （2）以电荷为依据： 离子交换色谱（低离子强度、适当pH） DEAE- Sephadex、 CM- Sephadex、 DEAE-纤维素、CM-纤维素；电泳（电荷、分子大小、分子形状）、纤维素粉末、淀粉、聚丙烯酰胺；等电聚焦（pH梯度中的平衡位置） （3）以溶解度变化为依据：改变pH、改变离子强度、降低介电常数 （4）以特异性结合位置为依据：亲和色谱、亲和洗提 （5）其它方法：热变性、在磷酸钙凝胶柱上分级吸附、羟基磷灰石色谱、疏水色谱、用水溶性的非离子聚合物（聚乙二醇）沉淀、冷冻干燥浓缩 (1) 以大小或质量为依据 1.1 离心 1.2 凝胶过滤 1.1 离心 原理：以质量不同为分离依据 离心力:5000-50000g 处理量可达几升 分离对象:细胞碎片、沉淀下来的酶 高速离心 速度一般在20,000 g以下。 超离心 相对离心力场速度在75,000 g以上，在80,000~250,000 g 之间。利用物质密度的不同，经超速