.中国海洋大学基因工程L4 第二章 PCR技术.pptVIP

* 列出四种鉴定亲缘关系或进化关系的方法，原理 若可得恐龙的DNA ,如何通过PCR和基因克隆检测恐龙是温血或变温爬行动物 * 列出四种鉴定亲缘关系或进化关系的方法，原理 rDNA、RFLP、RAPD、SSR(ISSR)、DNA fingerprinting 若可得恐龙的DNA ,如何通过PCR和基因克隆检测恐龙是温血或变温爬行动物 酶的克隆和表达-酶的热稳定性和最适温度检测和比较-温血动物的范围广 * 复习提纲 1、什么是PCR?其原理什么？PCR反应的典型过程怎样？ 2、PCR反应中的引物设计有什么样的原则？ 3、什么是热启动？ 4、用于PCR的几种DNA 聚合酶有什么样的特性？ 5、PCR反应中对金属离子和模板的要求是什么？ 6、难于扩增得到长片段产物的原因及其解决办法。 7、什么是平台效应？其产生的原因是什么？ 8、如何进行PCR 污染的控制？ 9、如何判断PCR产物的特异性？ * 10、利用PCR技术如何进行点突变？ 11、什么是锚定PCR？应用于怎样的研究？ 12、什么是不对称PCR？应用于怎样的研究？ 13、什么是表达子PCR? 应用于怎样的研究？ 14、什么是反向PCR？应用于怎样的研究？ 15、什么是原位PCR? 应用于怎样的研究？ 16、什么是RAPD？应用于怎样的研究？ 17、如何进行PCR产物的分析？ * 第二章 PCR技术 * 一、PCR技术的诞生与发展 聚合酶链反应（ Polymerase Chain Reaction，PCR ）又称为PCR 扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序。 1985年，美国PE-cetus公司人类遗传研究室的 Kary Mullis发明了具有划时代意义的PCR技术； 1988年，美国PE-cetus公司推出世界上第一台 PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化； 1993年，Kary Mullis因发明PCR技术获得诺贝 尔化学奖； 1995年，定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实。 * 定义：在体外的无细胞体系中模拟天然DNA复制过程的使目的DNA的量增加的反应。 二、原理 * 循环denature 94 ?C 30Sannealing Tm-5 ?Celongate 72 ?Ccycle 25-35 * 三、PCR反应成分 1、引物(Primer): 15-30nt 设计原则 *引物间 ---ACGC ---GAGC *引物内 --AACTGTT-- *GC% *末端保守性 *兼并碱基 2、 Taq酶 * DNA聚合酶对PCR精确性的重要影响 DNA聚合酶的保真性主要取决于其3’→5’的核酸外切酶活性，它 负责对错误掺入的碱基进行校正。相关研究结果表明，DNA聚合酶的 出错率在每轮延伸每核苷酸1.6 X 10–6 - 2.1 X 10–4范围内。DNA聚合 酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性： 与dNTP的结合特异性 磷酸二酯键的形成速率 焦磷酸的释放速率 碱基错误掺入之后的持续延伸性 3’→5’的核酸外切活性的强弱 * 用于PCR的DNA聚合酶简介 Klenow Thermus aquaticus 72?C 35-100nt/s/mol The large spring above, near Great Fountain Geyser, Yellowstone, was the source of the culture of Thermus Aquaticus Taq , discovered by Thomas Brock, U. Wisconsin in 1968). * Taq DNA酶的聚合出错率较高（2.1X10-4），因为它没有3’→5’的 的核酸外切酶活性和校正功能。然而通过优化反应条件，可使Taq酶 的聚合出错率降低到原来的1/3。Taq DNA聚合酶催化的聚合反应的 的可能性，则Taq DNA酶还常常导致扩增产物的缺失突变。 Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus） 普遍错误类型是由AT转换为GC；如果模板DNA具有形成二级结构 避免稀释保存Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在室温下也具有延伸引物的活性 (Hot Start) Taq DNA酶在使用时应注意： * 用于PCR的DNA聚合酶简介 KlenTaq DNA聚合酶是一种N端缺失了的Taq DNA聚合酶，因而 没有5’的核酸外切酶活性； KlenTaq DNA聚合酶的Mg2+最佳浓度范围很宽，因此很容易优化 KlenTaq DNA聚合酶（Thermus aquaticus） 在最佳反