IP-10+SiRNA对血管平滑肌细胞增殖影响及其对血管再狭窄防治作用.pdf

IP-10 SiRNA对血管平滑肌细胞增殖的影响及其对血管再狭窄的防治作用 l P-10Si RNA对血管平滑肌细胞增殖的影响 及其对血管再狭窄的防治作用 专业名称：外科学 硕士研究生：胡玲玉 导 师：胡作军副教授 中文摘要 研究背景 血管再狭窄是限制血管成形术远期疗效的主要原因，是一系列复杂的病理生 理过程联合作用的结果，以血管平滑肌细胞扩增、迁移为主要病理特征。研究表 明，IP．10可能具有潜在的促进血管平滑肌细胞扩增和迁移的作用，在动脉粥样 硬化形成的过程中，血管壁细胞IP．10的高表达在活化T细胞的募集和定植中发挥 了作用，粥样斑块的内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞均有IP．10的高表达。在 同种异体移植物的血管病变中，IP．10的高表达促进了以免疫介导的平滑肌细胞 扩增为特征的血管病变的发生。针对血管再狭窄的病理基础，我们试图将IP．10 作为新的靶点，运用具有高效、高特异性的RNA干扰技术，沉默其在血管平滑 肌细胞中的表达，研究其在血管平滑肌细胞扩增过程中发挥的作用，并进一步研 究其在体内血管再狭窄复杂过程中发挥的作用。 目的 增殖的影响，探讨IP．10在血管损伤后内膜过度增生过程中发挥的作用。 方法 2．0．U6，并进 IP一10的2条小干扰RNA，构建针对IP-10的SiRNA表达质粒pSilence n IP-10 SiRNA对血管平滑肌细胞增殖的影响及其对血管再狭窄的防治作用 行酶切鉴定和测序； 2、原代培养血管平滑肌细胞，将构建好的IP．10SiRNA真核表达质粒转染入 原代培养平滑肌细胞中，RT-PCR及Westernblot检测细胞IP．10表达，MTT法检测 细胞增殖速率； 3、球囊扩张加高胆固醇饮食构建新西兰兔左颈总动脉内膜损伤模型，将 IP．10 S诹NA局部转染入损伤血管，分别于转染后1周和4周末取标本，RT-PCR．和 免疫组化检测IP．10表达；HE染色观察血管形态，比较血管内膜中膜比；电子显 微镜观察血管内膜增生状态。 结果 1、酶切结果显示重组质粒插入片段大小与预期相符，测序结果证实该重组 质粒序列与所设计序列完全一致，表明针对IP．10的SiRNA真核表达质粒构建成 功。 2、IP．10 SiRNA转染后48dx时，细胞IP．10表达与未转染组比较明显降低， 细胞生长速度减慢(PO．05)。 3、兔颈总动脉转染IP．10SiRNA一周和四周后，IP．10局部表达较未转染组 明显降低。4周时，转染组血管内膜中膜比较未转染组减少(PO．01)，同时，电 子显微镜下，干扰组内膜结构较未转染组规则、平整，增生较轻。 结论 1、设计、合成了一个针对IP．10的特异性RNA干扰核苷酸序列，成功构建了 针对IP．10基因的SiRNA真核表达载体。 2、SiRNA表达载体转染可有效抑制内源性基因表达，本研究中质粒 111】[ⅢA和蛋白水平表达，并抑制血 pSileneer2．0．U6．siIP．10转染可有效抑SrJIp．10 管平滑肌细胞增殖。 IP．10表达的下调减轻了内膜损伤后新生内膜过度增生。 综上所述，IP．10在血管损伤后内膜增生过程中发挥了重要作用，通过小干 扰RNA技术沉默IP．10的表达可以抑制血管平滑肌细胞异常增生，从而减轻内膜 损伤后新生内膜过度增生。 关键词：IP．10；内膜增生；平滑肌细胞；小干扰RNA TTI IP一10 SiRNA对血管平滑肌细胞增殖的影响及其对血管再狭窄的防治作用 smoothmusclecells InterferenceofIP．．10in