原核蛋白表达和纯化.pptVIP

The key of Prokaryotic protein expression and purification ;原核表达概述 原核表达策略选择 表达结果验证 常见问题与实验例 ;原核表达原理概述 表达载体 表达菌株 表达条件;原核表达原理概述;表达载体;常见启动子 λpL启动子： 热诱导启动子 trp启动子： 化学诱导启动子 trc启动子： trp+lac杂交启动子 tac启动子： trp+lacUV5杂交启动子； pGEX（Pharmacia）、pMal（NEB） T7/T7lac启动子： pET（Novagen）、pEASY-E1/E2（Transgen）;T7启动子;T7lac启动子;融合标签;N端融合： 易于构建。终止密码子来自载体/基因 表达量高 提前终止会干扰纯化 二级翻译起始不影响纯化; C端融合： 构建时注意避免移码 基因不能自带终止密码子 提前终止不影响纯化 二级翻译起始会干扰纯化;常用融合标签 His·Tag pET系统 GST·Tag pGEX系统 MBP·Tag pMal系统;系统名称;表达菌株;表达???件;乳糖操纵子与诱导物;常用表达条件的优化;根据实验目的选择表达策略 载体选择 感受态细胞选择 表达条件;根据实验目的选择表达策略;实验目的 表达策略 活性分析 可溶表达 制备抗原 包涵体 高纯度 融合标签 结构研究 天然蛋白 …… ……;选择表达载体;选择表达菌株;Page Up;优化表达条件;ArtMediaTM Protein Expression（AM PE）;4;载体：pEASY-E1蛋白：70 kDa菌株：Transetta(DE3) Lane 1: LB培养基，对照Lane 2: LB培养基，IPTG诱导Lane 3: AM-PE自动诱导;表达定位 ;表达定位;沉淀;常见问题与实验例;无表达或表达量低;无表达或表达量低;1：BL21(DE3)； 2：Rosetta(DE3) ； 3：BL21(DE3)pLysS;无表达或表达量低;1;蛋白不可溶;增加可溶表达;1;促进包涵体形成 目的 高浓度，高纯度 毒基因表达 免受蛋白酶水解（小蛋白，多肽） 手段 胞质表达 提升表达速率（诱导温度，IPTG浓度，etc） 特定的表达载体（pET-17xb，pET-31b(+)） ;蛋白纯化障碍 ; 纯化策略选择 亲和层析与离子交换层析 层析方法的组合与顺序 包涵体纯化与复性 ;根据蛋白自身特点选择纯化方案 常用实验流程;蛋白自身特点;可溶/包涵体;融合标签;表面净电荷 与蛋白质等电点、溶液pH值密切相关 离子交换层析的重要标准;常用实验流程;菌体裂解;蛋白质预处理(可溶);蛋白质预处理(包涵体);层析纯化;骄姚瓶副梢歉胞训兹萧儒金诡仔攫摸否鳖挣肺芜塑只忌屁徐逸沮症戌竭徐原核蛋白表达和纯化原核蛋白表达和纯化;亲和层析;金属螯合层析——6×His·Tag纯化;基本原理与特点;Ni2+与组氨酸形成配位键;Ni-NTA;常用纯化流程;常见问题与技巧;1-S;蛋白杂带多 洗脱条件不合适——咪唑浓度、pH值 梯度洗脱 非特异性结合 上调初始咪唑浓度 β-ME 非离子型去垢剂、甘油、NaCl…… 蛋白不完整——蛋白降解、提前终止（N端）、二级翻译起始（C端） 低温，蛋白酶抑制剂 重新构建 填料过多;无初始咪唑;无β-ME;N端融合;蛋白提前洗脱 洗脱条件不合适——咪唑浓度、pH值 改变洗脱条件 蛋白结合能力弱 下调初始咪唑浓度;蛋白洗脱无检出 洗脱条件不合适——咪唑浓度、pH值 增加洗脱强度 蛋白结合能力强 上调初始咪唑浓度 蛋白浓度低 Western Blot 优化表达 蛋白未结合或被提前洗涤 电泳检查全部样品：上样前、流出、洗涤、洗脱;S;GST标签基本原理与特点;GST;离子交换层析;离子交换层析原理;尚怯窍倦煽港颅甜抵伊踩谓渗演辑仔遭挤宦趋羊驶蹦裁松送择扯突赃输眯原核蛋白表达和纯化原核蛋白表达和纯化;离子交换层析分类;离子交换层析特点;S; ; ;DEAE;DEAE; 包涵体洗涤 包涵体变性与纯化 包涵体复性 ;包涵体洗涤 ;包涵体洗涤 ;1;包涵体变性与纯化 ;变性方法 变性剂 尿素/盐酸胍 8 M/6 M 助溶剂 SDS ≤0.5% 还原剂 DTT/β-ME pH 磷酸钠系统 ~8.0 其它助溶手段： 加热/极端pH值……;;二硫键与还原剂对变性的影响 二硫键 2个SH基被氧化而形成 有助于蛋白质正确折叠 阻碍包涵体的彻底