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DNA测序技术的发展及其最新进展 摘要：自从诺贝尔奖得主桑格于1977年发明了第一代DN测序技术以来，DNA测序技术已经作为重要的实验技术广泛的应用于现代生物学研究当中。经过了几十年的发展，DNA测序技术日臻成熟，并且以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经诞生。本文主要就每一代测序技术原理和特点及其最新进展做简要介绍。 关键词：DNA测序技术；第三代DNA测序技术；最新进展 The Development and New Progress of DNA Sequencing Technology Abstract: Since Nobel Prize Winner Sanger have founded the first generation of DNA Sequence technology in 1977, DNA sequencing technology has been widely used in modern biological researches as an important experimental. Over decades of year’s development, DNA sequence technology mature gradually and the third generation sequencing technologies characterized by single-molecule sequencing have also emerged. The mechanisms and features of each generation of sequencing technology and their latest progress will be discussed here. Key Words: DNA Sequence technology ; third generation DNA sequencing ;latest development 1.引言 DNA测序技术是分子生物学研究中最常用的技术,它的出现极大地推动了生物学的发展。自从1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构后[1]，人类就开始了对DNA序列的探索，在世界各地掀起了DNA测序技术的热潮。1977年Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法[2]。同一时期,Sanger发明了双脱氧链终止法[3]。20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代DNA测序技术。最近几年发展起来的第二代DNA测序技术则使得DNA测序进入了高通量、低成本的时代。目前,基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现,该技术测定DNA序列更快,并有望进一步降低测序成本,推进相关领域生物学研究。本文主要介绍DNA测序技术的发展历史及不同发展阶段各种主要测序技术的特点，并针对目前新一代DNA测序技术及目前国际DNA测序最新进展做简要综述。 2.第一代测序技术 早在1954年，Whitfeld等就提出了测定多聚核糖核苷酸链的降解法[4]，该方法利用磷酸单酯酶的脱磷酸作用和高碘酸盐的氧化作用从链末端逐一分离寡核糖核苷酸并测定其种类。但由于操作复杂等原因，该方法并没有被广泛应用。在1977年，Sanger等提出了经典的双脱氧核苷酸末端终止测序法[5]。该方法的原理是：由于ddNTP的2′和3′都不含羟基，在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键，因此可以被用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种ddNTP，通过凝胶电泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。同一年，Gilbert等提出了化学降解法[6]。该方法与Sanger法类似，都是先得到随机长度的DNA链，再通过电泳方法读出序列。二者的不同之处在于，Gilbert法是先用特定的化学试剂标记碱基再用化学方法打断待测序列，而Sanger法是通过ddNTP随机中断合成待测序列。此后，在Sanger法的基础上，80年代中期出现了以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪[7]。另外，90年代中期出现的毛细管电泳技术使得测序的通量大为提高[8]。除此之外，这一时期还出现了一些其他的测序方法，如焦磷酸测序法[9]、连接酶测序法 [10] 、杂交测序法 [11]等。其中焦磷酸测序法即为后来Roche公司454技术使用的测序方法，连接酶测序法即为后来ABI公司SOLiD技术使用的测序方法。 3.第二代测序技术 随着人类基因组计划的完成，人们开始进入后基因组时代。科学家逐步测出多种