RNA提取与反转录合成cDNA具体实验步骤.docVIP

RNA提取及反转录合成cDNA具体实验步骤 由 杨盛 于 2011/6/8 12:56 创建 一、RNA提取前的准备 RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施： 1、戴一次性手套； 2、使用RNA操作专用实验台； 3、在操作过程中避免讲话等。 通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。 二、使用器具 尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理： 1、用0.1%DEPC水溶液在37℃下处理12小时， 2、然后在120℃下高温灭菌30min以除去残留的DEPC， （ RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其他实验。） 三、 试剂配制 用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60min）或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。 RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。 四、实验操作 在研磨样品前，先把所要用到的试剂和枪头、研钵（未拆开报纸）放在超净工作台上，打开紫外灯照射20-30min杀菌。 1. 50-100mg的普通组织样品：RNAiso Plus 1ml 2. 试验样品的研磨和匀浆 （1）将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研钵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的课件颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。（研磨好的样品立即加入 RNAiso Plus） （2）对于普通的RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的RNAiso Plus，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。 （3）将匀浆液转移至离心管中，室温静置5min。 （4）12000g 4℃离心5min。 （5）小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。 3.Total RNA 的提取 （加入RNAiso Plus 后，静置5min，离心转移上清，避免未破碎的杂蛋白污染） （1）向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus 的1/5体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15s（氯仿沸点低，易挥发，振荡时应小心离心管突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置5min。 （2）12000 g 4℃ 离心15min。 （3）从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。 （4）向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15-30℃下静置10min。 （5）12000g 4 ℃ 离心10min。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。 4.RNA沉淀的清洗 小心弃去上清，缓慢的沿离心管壁加入75%的乙醇（用DEPC-Water配制）1ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管壁，12000g 4℃离心5min后小心弃去乙醇（为了更好的控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。 5.RNA的溶解 室温干燥沉淀2-5min（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解，有关RNA溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明），加入适量的Rnase-free水溶解沉淀，必要时可以用移液抢轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。（提取的RNA立即进行反转录，确保RNA不降解，剩余的RNA标记好放到旁边-80℃冰箱保存。） PCR扩增 1.反转录反应 (1)在Microtube管中配制下列混合液 Dntp Mixture(10Mm each) 1ul Oligo Dt Primer (2.5uM) 1ul Total RNA 5ul Rnase Free dH2O Up to 10 ul (2) 在PCR仪上进行变性、退火反应。 65℃5min 4℃ （说明：变性、退火操作有利于模板RNA的变性以及反转录引物和模板的特异性退火，可提高反转录反应效率） (3) 离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底中。 (4) 在上述Microtube管中配制下列反转录反应液 上述变性、退火后的反应液 10ul 5×PrimeScript TM Buffer 4ul Rnase Inhibitor (40U/ul) 0.5ul PrimeScript TM Rtase (for 2 Step) 0.5ul Rnase Free Dh2O 5ul Total Volume 20ul (反转录的体系做成40ul) (5) 在PCR