用于基因芯片分析的血液样品的准备.docVIP

　用于基因芯片分析的血液样备红细时进 下面方法是我们实验术过 一、实验材料： 淋巴细胞分离液（天津TBD生物技术发展中心）； 灭盐0.9%生理盐水灭菌即可）； Trizol试剂Invitrogen公司） 各种取样器具高温灭菌即可； 仪设带转头 具体过程：以2 ml全血为 1、将2 mL抗凝血（肝素或者EDTA盐抗凝都可），以3,500 转/分，离心10分钟2层浆约60%，见图1 图1 血液抗凝后通过离心分离血细胞和血浆层 2、用巴士滴管或吸管将上层血浆吸出，还1ml血细胞层，在血细胞层中加入1：1体积1ml的灭菌生理盐水，混匀，见图2。 图2 在血细胞中加入生理盐水充分混匀 3、以下是把12ml生理盐水与血细胞混合物（相当于12ml全血）合并成一管后分离白细胞过程。将24 mL淋巴细胞分离液（是全血体积的2倍）预50 mL 离心管中。将与生理盐水混合的血细胞缓让3；然后以1500转/分，离心20 分钟（离心机要求水平转头）。可以看到液体分为三层，上层是淡黄色的血浆，中间处显较虑2500转/分，继续10 分钟以加强白细胞的分离效果），见图4。 　　　 图3 将与生理盐水混合的血细胞缓慢加入　　　　图4 血细胞在淋巴分离液中的分离效果 淋巴细胞分离液液面上 　　 4、用巴士滴管或移液器收集界面上的白细胞层，放入灭菌的1.5 mL EP离心管中，以 10,000 转/分，离心5 分钟，吸掉上清。可见白色的沉淀，有时白色的沉淀上还混有红色的血细胞（少量红细胞无妨），见图5。 图5 分离的白细胞再次离心后形成的沉淀 5、吸去上清液，在细胞沉淀中，加入1ml Trizol试剂，用移液器充分抽打，混匀，直到形成清亮不粘稠度的液体（表明细胞被充分溶解，基因组DNA 6、后续可以按照Trizol试剂的标总RNATrizol试剂保存在生物冰（低于15℃即可）邮给5 ml全血可以得到10-15ug总RNA，得到的总RNA质量如图6所示： 图6 白细胞中抽提RNA的电 注意事项 A. 在一些方法中，是在全血中直接加淋巴细胞分离液后离心分离红细胞；这RNA的抽提，因此我们建议 B. 在一些方法中，分离得到的白细胞先用RNAlater保存进行运输污 RNAlater的保存效果；另外，保存在RNAlater中的白细胞在重新回收提取RNA时还有部分损 因此若实验室有Trizol试剂，我们建议直接用Trizol试剂把白细胞溶解，在Trizol试剂中的RNA是相对稳-20℃可以保存一个星期，-70℃可以保存一个月。 C. 淋巴细胞分离液一般要求保存在4℃中。淋巴细胞分离液从冰箱取出后，不要马应变 D. 整个分离过程中，温度应在18-28℃；温度过高与过低均影响分离质