三七总皂苷对糖尿病大鼠肾皮质p22phoxmRNA表达影响.docVIP

三七总皂苷对糖尿病大鼠肾皮质p22phoxmRNA表达影响糖尿病肾病(DN)的发病机制尚不完全清楚，目前已知氧化应激反应增强、活性氧(ROS)产生增多在糖尿病肾病的发生发展中发挥了重要的作用。最近，NAD(P)H氧化酶因参与氧化应激过程而受到关注，P22phox是NAD(P)H氧化酶的一个必需亚单位，在维持其活性中起重要作用。临床研究表明中药三七对DN有着良好的疗效，本实验通过观察三七总皂苷(PNS)对糖尿病大鼠肾皮质p22phox mRNA表达的影响及其对肾脏的保护作用，以探讨三七总皂苷防治DN的作用机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物：SD清洁级3月龄大鼠35只，雄性，体重150～200g，浙江省医学科学院实验动物中心提供。大鼠饲养于清洁级动物室，室温21～25℃。 1.2 试剂：链脲佐菌素(STZ)、氨基胍(AG)为美国Sigma公司产品；血栓通胶囊(每粒含三七总皂苷100mg)为黑龙江珍宝岛制药有限公司产品；血糖测定试剂盒由上海丰汇医学科技有限公司提供；尿蛋白定量测定试剂盒由南京建成生物工程公司提供；总RNA抽提试剂Trizol、逆转录酶试剂盒、Taq DNA聚合酶由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；DNA梯度Marker由Takara公司提供。 1.3 引物：搜索GenBank数据库大鼠p22phox mRNA序列，利用Primer Premier引物设计与分析软件设计p22phox及内参GAPDH引物，委托上海生工生物工程公司合成，序列如下：p22phox引物：上游：5-GACGCTTCACGCAGTGGTACT-3’，下游：5-CACGACCTCATCTGTCACTGG-3’，目标长度：485bp；GAPDH引物：上游：5-GTCGGTGTGAACGGATTT-3’，下游：5-ACTCCACGACGTACTCAGC-3’，目标长度：276bp。 1.4 方法与步骤：分述如下。 1.4.1 造模、分组及治疗：适应性饲养大鼠1周。造模前将所有大鼠随机分为正常对照组(NC组，6只)和造模组(29只)。STZ临用前用0.1mol／L无菌枸橼酸钠缓冲液(pH4.4)配成2％的溶液，放于冰浴中。糖尿病造模组大鼠禁食不禁水14小时，将STZ以65mg／kg一次性于大鼠左下腹腔注射造模，两小时后给大鼠进食。正常对照组按相同的方法和剂量注射枸橼酸钠溶液。72h后至少连续3天尾静脉检测血糖(Glucose Glu)。以连续3次血糖16.65mmol／L，尿量原尿量的150％，饮水明显增多者为大鼠糖尿病成模标准［1，2］。造模后选取符合成模标准，状态稳定的糖尿病大鼠(24只)，随机分为糖尿病模型组(DM组，8只)，三七总皂苷组(PNS组，8只)和氨基胍组(AG组，8只，在实验过程中死掉1只)，并予药物进行干预。其中，PNS组给予三七总皂苷100mgkg-1?d-1灌胃，AG组给予氨基胍100mgkg-1?d-1灌胃，DM组及NC组给予生理盐水1ml100g-1?d-1灌胃。共8周。 1.4.2 标本收集与处理：用药后8周末于处死大鼠前一天，用代谢笼收集大鼠24h尿标本，记录尿量后取5ml保存于-30℃冰箱中；大鼠称重后，从股静脉采血，分离血清待测；随后处死大鼠，取双肾，去掉肾包膜称重，右肾用10％中性福尔马林溶液固定，行PAS染色，左肾液氮冷冻，-70℃冰箱冻存，提取RNA。 1.4.3 指标检测：采用日立-7020型全自动生化分析仪检测血糖，用考马斯亮兰法检测尿蛋白，并计算24小时尿蛋白定量。 1.4.4 肾组织病理学检查及肾小球细胞外基质的检测：取适量右肾组织行石蜡包埋，制成厚度为3 μm切片，行PAS染色，光镜下观察大鼠肾脏病理变化。用北京航空航天大学全自动图像分析系统对PAS染色切片进行分析，每张切片按顺时针方向随机取10个完整正切肾小球，经分析系统计算每个肾小球PAS阳性染色面积与整个肾小球面积之比值，然后求10个肾小球此比值的均数，即为每张切片肾小球细胞外基质(ECM)的相对含量［3］。 1.4.5 肾皮质p22phox mRNA的检测：分别取各组大鼠肾皮质100mg，按Trizol试剂说明书操作，提取总RNA，所得RNA用紫外分光光度计测260nm／280nm处的紫外吸收值(OD值)，每个样品重复测3次。结果：所提取的RNA，A??260/280比值约在1.8～2.0。将所提取的总RNA经1％的琼脂糖凝胶电泳显示5s、18s和28s三条带，证实RNA无降解。 取5μg RNA样品，1μl Oligo(dT)??18加入一无RNA酶的200μl薄壁PCR管中，用灭活DEPC水补足至10μl，混匀。65℃加热10min，迅速冰水浴5min，短暂离心