中药复方益糖康对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化影响.doc

中药复方益糖康对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化影响摘 要:目的:探讨中药复方益糖康对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响。方法:培养3T3-L1前脂肪细胞;以四甲基偶氮唑盐(MTT)的方法检测益糖康对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响,通过流式细胞仪检测细胞增殖的周期;以油红O染色异丙醇萃取的方法检测益糖康对3T3-L1前脂肪细胞分化过程中脂肪积聚的影响。结果:10%含益糖康的大鼠血清,对3T3-L1前脂肪细胞的增殖影响最佳,细胞增殖在S、G2期与对照组比较增多;5%含益糖康大鼠血清抑制分化过程中的脂肪积聚最佳。结论:中药复方益糖康具有促进3T3-L1前脂肪细胞增殖,抑制3T3-L1前脂肪细胞分化的作用。 关键词:益糖康;3T3-L1前脂肪细胞;细胞增殖;细胞分化 中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0116-03 随着生活水平的提高,以肥胖为基础的2型糖尿病、代谢综合征逐渐成为研究热点,所以控制肥胖,减轻体重,改善胰岛素抵抗,成为此类疾病治疗的目标。中药复方益糖康在以往的体内实验中已经证明对糖尿病的治疗作用,对于高脂饲养加小剂量STZ(链脲佐菌素)造模的糖尿病大鼠,它具有减低其体重、改善胰岛素抵抗的作用。其中复方益糖康中黄连的主要成分小檗碱已证明具有降血糖、纠正脂类代谢的作用,临床用于治疗轻度2型糖尿病[1];人参、黄芪、枸杞均有调节糖、脂代谢的作用。3T3-L1前脂肪细胞在一定的条件下,可以分化成为脂肪细胞,广泛应用于脂肪细胞的研究。笔者观察益糖康对3T3-L1前脂肪细胞株的细胞增殖和分化的影响。 1材料和方法 1.1材料 1.1.1 药品与试剂中药复方益糖康购自辽宁中医药大学附属第一医院药局;益糖康处方组成:人参、黄芪、白术、茯苓、枸杞、葛根、赤芍、大黄、黄连等;DME含酚红低糖培养基购自Thermo Hyclone公司;胎牛血清购自天津灏洋生物有限公司;碘化丙啶(PI)购自碧云天生物技术研究所;MTT购自Amresco公司,二甲基亚砜(DMSO)购自宜兴市化工厂;油红O、异丁基-甲基-黄嘌呤、地塞米松、胰岛素购自Sigma公司; 1.1.2仪器与设备二氧化碳培养箱Thermo HEPA class100;培养瓶、培养板购自Korning公司;低温高速离心机Sigma3k30,购自Sigma公司;酶标仪UQuant200-999,Bio-Tek公司;流式细胞仪FACS calibur,Beeton Dickinson公司。 1.1.3细胞株与动物3T3-L1前脂肪细胞株购自上海生命科学院细胞库;8周龄清洁级SD大鼠20只,雄性,由辽宁中医药大学实验动物中心提供,合格证号:辽实动物2004―0018。 1.2方法 1.2.1含复方益糖康大鼠血清的制备购买20只SD雄性大鼠,按人等效剂量灌服复方益糖康药物,共7天,每天2次。最后一次灌胃后1h,腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠,取腹主动脉血,放置4h后,2500r/min离心取血清,-20℃冻存备用。做MTT试验前,取大鼠含药血清与含10%胎牛DMEM低糖培养基,按含药量为5%、10%、15%、20%,制备含药培养液。 1.2.2益糖康对3T3-L1前脂肪细胞增殖影响的MTT实验取对数生长期3T3-L1前脂肪细胞,用PBS液洗涤1次,用0.25%胰酶400μL消化后,再以含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液配成104个/mL的细胞悬液。以每孔200μL体积接种于96孔板,按益糖康大鼠含药血清5%、10%、15%、20%、及空白组共5组,每个浓度重复8孔,置37℃、5%CO2培养箱培养。培养分别为24h、48h后,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL,37℃继续孵育4h,终止培养,小心弃去孔内培养液。每孔加入150μL DMSO,振荡10min,使结晶物充分溶解。酶标仪490nm波长测定各孔的光密度值[2]。用SPSS 10.0软件,t检验进行统计分析。结果培养48h,含药浓度为10%的血清,促进增殖明显,P0.05。 1.2.3益糖康对3T3-L1前脂肪细胞增殖影响的流式细胞仪检测取对数生长期3T3-L1前脂肪细胞,分为两组,于培养瓶中培养。一组为含益糖康大鼠血清10%的低糖DMEM培养液进行培养,另外一组为空白对照组,共培养48h。用PBS洗细胞后,用0.25%胰酶400μL消化并收集细胞,再用PBS洗2次,重悬后,加75%冷乙醇固定15min,4℃保存过夜。上机前,再用PBS洗细胞3次,重悬,调整细胞密度为106/mL,每组3个样品。加RNase(50mg/L),于37℃处理30min,加PI(80mg/L),避光染色15min,上机检测。 1