耐药基因检测.doc

作业指导书 第1页 共4页 文件编码： 第1版 第0次修改 文件名称：耐药基因型检测操作规程作业指导书 颁布日期 2007年01月07日 耐药基因型检测操作规程作业指导书 目的 本操作规程是关于使用in-house方法进行耐药性检测过程标准操作和结果分析保存的规程。 适用范围 适用于HIV-1耐药基因型测定。 职责 在使用in-house方法进行耐药性检测过程中，研究人员必须依照本标准操作规程进行操作。 作业程序 核酸提取：推荐使用QIAGEN公司QIAamp ò Viral RNA Mini Kit 提取RNA。 引物 4.2.1 扩增引物 第一轮 PCR： 外侧上游引物MAW 26 ：5’-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3’; HXB2 2028-2050 外侧下游引物RT21 ：5’-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3’; HXB2 3509-3539 第二轮 PCR： 内侧上游引物 PRO-1 ：5’-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3’; HXB2 2147-2166 内侧下游引物 RT20 ：5’-CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC-3’; HXB2 3441-3462 4.2.2 测序引物 正向测序引物： PROS3 ：5’-GCCAACAGCCCCACCA-3’ RTAS ：5’-CTCAGATTGGTTGCAC-3’ RTBS ：5’-CCTAGTATAAACAATGAGACAC-3’; HXB2 2946-2967 反向测序引物： PROC1S ：5’-GCTGGGTGTGGTATTCC-3’ RT20S3 ：5’-GTTCTAGCTCTGCTTC-3’ 参照国际标准株HXB2株（全基因1-9719bp）POL基因序列(2253-5096bp)，其中蛋白酶(2253-2549bp)，逆转录酶基因(2250-4229bp)，整合酶基因(4230-5096bp)。我们所使用的方法扩增产物长度为1.3kb，包括蛋白酶基因全长（1-99 codon）和逆转录酶基因前300个氨基酸(1-300 codon)。 准备RT-PCR（逆转录及第一轮PCR）反应体系：在PCR准备间安全柜内进行，注意配置过程应在冰上进行。推荐使用Takara One Step RNA PCR Kit(AMV)，总体系25μl，见下表： 反应数 1 4 10 16 24 10*buffer 2.5 10 25 40 60 MgCl2 5 20 50 80 120 dNTP 2.5 10 25 40 60 MAW26 0.5 2 5 8 12 RT21 0.5 2 5 8 12 RT 0.5 2 5 8 12 taq 0.5 2 5 8 12 RNase Inhibitor 0.5 2 5 8 12 ddH2O 7.5 30 75 120 180 template 5 　 　 　 　 4.3.1将除酶以外的试剂取出置于室温，待其溶化后震荡混匀5秒钟，短暂离心后置于冰上备用。 4.3.2酶及逆转录酶抑制剂取出置于冰上，使用后立即放回-20℃保存。 4.3.3准备PCR管，管身标记清楚编号，置于冰上备用。 4.2.4使用1.5ml离心管配制RT-PCR反应体系（单位 μl），按每管20μl将配制好的反应体系分装至PCR管中，注意将液体加至管底。 RT-PCR（逆转录及第一轮PCR） 4.4.1将分装好的PCR管拿到加样间，分别将样本RNA、阳性对照样本RNA及阴性对照样本RNA各5μl加入相应PCR管中。注意不要发生交叉污染。 4.42 将混合物混匀并短暂离心后放入PCR仪中，设定程序： 50℃ 30分钟；94℃ 5分钟； 94℃ 30秒 ，55℃ 30秒，72℃ 2分30秒，30 cycles； 72℃ 10分钟，4℃ 保温。 运行程序。 4.5 第二轮PCR 4.5.1 在PCR准备区配制反应体系，注意配置过程应在冰上进行。推荐使用Takara Perfectshot TM Ex Taq Mix，总体系50μl，见下表： 反应数　 1 4 10 16 24 Mix 25 100 250 400 600 PRO-1 1 4 10 16 24 RT20 1 4 10 16 24 ddH2O 18 72 180 288 432 template 5 　 　 　 　 4.5.2 反应体系的配制同RT-PCR。体系配制完成后，按照每管 45μl将配制好的反应体系分装到PCR管中。 4.5.3将分装好的PCR管拿到加样间，将第一轮反应产物各5