桂枝茯苓丸对荷瘤鼠肿瘤细胞PCNA P21waf-cip影响 .docVIP

桂枝茯苓丸对荷瘤鼠肿瘤细胞PCNA P21waf/cip影响 王　琪　罗晓庆 摘　要：目的：探讨桂枝茯苓丸的抑瘤机制，为桂枝茯苓丸(GFW)开发应用提供实验依据。方法：计算抑瘤率，SP免疫组化法测定增殖细胞核抗原PCNA、抑癌基因P21waf/cip蛋白表达。结果：GFW抑瘤率为38.93％，GFW抑制肿瘤细胞PCNA蛋白表达，GFW组与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。GFW上调肿瘤细胞p21waf/cip蛋白表达，GFW组与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。结论：桂枝茯苓丸的抑瘤作用可能与上调P21waf/cip及下调PCNA表达密切相关。 关键词：桂枝茯苓丸；PCNA；P21waf/cip 中医认为血瘀是肿瘤的主要成因之一，桂枝茯苓丸是一活血化瘀方剂，广泛用于各种血瘀症的治疗，临床实践证明具一定的抑瘤作用，但对其抑瘤机理的研究并不深入。本文选用荷瘤小鼠作为研究对象，观察桂枝茯苓丸(GFW)对细胞周期相关基因PCNA、P21waf/cip蛋白表达的影响，以其从分子水平上探讨GFW抗肿瘤效应机理，为GFW的临床应用提供理论依据。 1 材料与方法 1．1 主要仪器和试剂PCNA、P21waf/cip单抗、免疫组化染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。OLYM-PUS显微镜(日本)、SB651旋转蒸发仪(日本RIKAKI公司)、HIMAS-2000多媒体彩色病理图文分析系统(齐齐哈尔医学院中心实验室所有)。 1．2实验动物40只昆明小鼠，体重(20±2)g，雄性，由齐齐哈尔医学院实验动物中心提供。 1．3瘤株S啪瘤株，由黑龙江省肿瘤研究所提供。 1．4药物 桂枝茯苓丸：按《金匮要略》记载标准，生药均购自齐齐哈尔市中医院。桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、赤芍各药等量，加适量水，浸泡2h，先文火后武火煎煮两次，经过滤除渣后，水浴浓缩，配成lg/mL的水煎剂，置4℃保存备用。环磷酰胺(cylophosphamide，CY)，山西普德药业有限公司出品，批号 1．5动物模型取腹腔接种10天的荷瘤小鼠，在无菌条件下抽取腹水(乳白色，黏稠)，放入无菌容器内，置冰块保存。用0.4％台盼蓝生理盐水液计数(计活细胞大于95％)，用生理盐水调细胞浓度至S×100/mL。取KM小鼠30只，每只鼠右侧腋下皮下注射0.2mL瘤细胞悬液。 1．6 动物分组及给药方法将荷瘤鼠随机分为3组，每组10只，分别为模型组、实验组、CY组，另取10只未荷瘤小鼠作为正常对照。模型组(Model group)：生理盐水灌胃0.2mL/(10gd)；中药组(GFW group)：GFW灌胃0.2mL/(10gd)；环磷酰胺组(CY group)：腹腔注射CY20mg/(kgd)。接种后次日给药，各组每天给药1次，连续10天。 1．7 抑瘤率的测定停药次日，处死小鼠，剥取瘤组织。电子天平称量瘤重，计算抑瘤率。抑瘤率=(模型组平均瘤重一实验组平均瘤重)/模型组平均瘤重。 1．8 免疫组化法检测PCNA 瘤组织切片常规脱蜡至水，3％H2O2室温封闭10min，蒸馏水冲洗，PBS洗，0.1mol/L枸橼酸缓冲液抗原微波修复，滴加封闭液，37℃ 20min，滴加1:200稀释的PCNA单抗4℃过夜，PBS洗，滴加生物素标记的二抗，37℃ 20min，PBS洗，滴加辣根酶标记链酶卵白素，37℃ 20min，PBS洗，DAB显色。苏木素复染，常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。PBS代替一抗作阴性对照。 1．9 免疫组化法检测P21waf/cip瘤组织切片常规脱蜡至水，3％H2O2室温封闭10min，蒸馏水冲洗，PBS洗，0.lmol/L枸橼酸缓冲液抗原微波修复，滴加封闭液，37℃20min，滴加1:100稀释的P21H2O2单抗4℃过夜，PBS洗，滴加生物紊标记的二抗，37℃20min，PBS洗，滴加辣根酶标记链酶卵自素，37℃20min，PBS洗，DAB显色，苏木素复染，常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。PBS代替一抗作阴性对照。 1．10 统计分析检测结果以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较用方差分析，两组问比较用snk法。 2 结果 2．1抑瘤率与模型组比较，GFW组、CY组瘤重低于模型组瘤重，差异有统计学意义(P＜0.05)。GEW组与CY组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。GFW组抑瘤率为38.93％。 2．2肿瘤细胞中PCNA蛋白表达S-P免疫组化方法染色后，将所制切片在光学显微镜低倍镜下观察细细胞核呈现明确的棕黄色颗粒状染色为阳性细胞，细胞核蓝染的细胞为苏木素复染的阴性细胞。在10×40倍高倍镜下，每张标