2，3吲哚醌对人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞增殖影响.docVIP

　　2，3吲哚醌对人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞增殖影响 【摘要】 目的 研究2,3吲哚醌对人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞增殖的影响。方法 应用MTT比色法观察2,3吲哚醌对SHSY5Y细胞生长的抑制情况；流式细胞仪检测2,3吲哚醌对SHSY5Y细胞周期分布的影响；ethods MTT method ine the effects of 2,3dioxoindoline on the proliferation of SHSY5Y cells, and floetry to determine the cell cycle. I 1640培养基购自Gibco公司；新生牛血清购自杭州四季青公司；四唑氮蓝（MTT）为Sigma公司生产；2,3吲哚醌购自上海元吉化工有限公司，实验时使用RPMI 1640溶解并过滤除菌。caspase3一抗、SP试剂盒，购自北京中杉生物技术有限公司。牛血清清蛋白（BSA）购自Amresco公司。兔抗人有丝分裂原激活的蛋白激酶(ERK) 抗体购自武汉博士德生物工程公司。过氧化物酶标记的驴抗兔抗体购自Amersham pharmacia biotech。 1.2 方法 1.2.1 2,3吲哚醌对SHSY5Y细胞形态影响的观察 将对数生长期的SHSY5Y细胞消化后，调整细胞浓度为109/L，接种于培养瓶中。37 ℃、体积分数0.05 CO2条件下孵育36 h后换新培养液，并加入2,3吲哚醌，使其终浓度分别为0、100、200、400 μmol/L，培养48 h后，倒置显微镜下观察细胞形态的变化。 1.2.2 2,3吲哚醌对SHSY5Y细胞的生长抑制作用检测 采用MTT比色法［5］。取对数生长期的SHSY5Y细胞，调整细胞浓度为108/L，接种于96孔板中，每孔细胞数1×104个，接种36 h后换新培养液，实验组加入2,3吲哚醌，使其终浓度分别为50、100、200、400 μmol/L，同时设立空白对照组（不加2,3吲哚醌，加入等体积的RPMI 1640培养液）。每孔体积为200 μL，每个浓度设12个复孔，分别培养24、48、72 h后，每孔加入新鲜配制的MTT（10 g/L）10 μL，继续培养4 h后，去除培养液，每孔加入100 μL DMSO溶解结晶30 min，用自动酶标仪（Rayto 2100C酶标仪）于490 nm处测定吸光度值。重复3次，取平均值，计算细胞生长抑制率。 1.2.3 2,3吲哚醌对SHSY5Y细胞周期影响的检测 取铺满瓶底的SHSY5Y细胞，去掉原液，加入新的细胞培养液准确调至5 mL。24 h后分别加入0、100、200、400 μmol/L浓度2,3吲哚醌，作用48 h后收集细胞，调整细胞浓度为(0.5～1.0)×109/L。将细胞悬液离心，弃上清，分别加入碘化丙啶（PI）作用30 min，然后，用流式细胞仪（Becton Dickinson，美国）进行细胞周期分析，每个样本分别约检测11 000个细胞，计算各期细胞数占细胞总数的百分率。 1.2.4 2,3吲哚醌对SHSY5Y细胞caspase3蛋白表达影响的检测 采用免疫细胞化学SP技术，取经100、200、400 μmol/L 2,3吲哚醌诱导的SHSY5Y细胞，以未经处理的细胞作为对照。分别用40 g/L多聚甲醛固定，按SP试剂盒说明操作，其中caspase3一抗效价为1∶50。光学显微镜下观察并判断结果，细胞染色呈棕褐色或棕黄色为阳性。caspase3蛋白定位于胞浆，也可见于胞核。连续观察5个高倍视野，计算阳性细胞百分率。 1.2.5 2,3吲哚醌对SHSY5Y细胞信号传导蛋白ERK的影响 取4瓶经0、100、200、400 μmol/L 2,3吲哚醌诱导的SHSY5Y细胞，细胞总蛋白的提取及期低于其他3组，差异均有显著性（F=17.29～48.01，q=7.12～19.87，Plt;0.05）；200 μmol/L组的3项指标与其他3组比较，差异均有显著性（q＝3.04～15.96，Plt;0.05）。见表1。 2.4 2,3吲哚醌对SHSY5Y细胞caspase3蛋白表达的影响 对照组、2,3吲哚醌100、200、400 μmol/L组caspase3蛋白阳性细胞数分别为（15.8±5.4）%、（25.6±8.2）%、（26.8±10.1）%、（28.9±12.1）%，加药组SHSY5Y细胞中caspase3蛋白阳性细胞数较对照组明显增多，差异有显著意义（F=25.65，q＝10.29，P lt;0.05）。随着2,3吲哚醌剂量的增加，其表达量有明显增多的趋势。 2.5 2,3吲哚醌作用后磷