AGE及葡萄糖对THP1巨噬细胞CXCL16mRNA表达的影响.docVIP

　　AGE及葡萄糖对THP1巨噬细胞CXCL16 mRNA表达的影响 【摘要】 目的： 探讨晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products， AGE)及葡萄糖对THP1巨噬细胞CXCL16 mRNA表达的影响. 方法： ①选择合适的培养时间；②不同浓度的AGE与THP1巨噬细胞共同孵育；③不同浓度葡萄糖与THP1巨噬细胞共同孵育；分别用AGE、葡萄糖及同时加入AGE和葡萄糖与THP1巨噬细胞孵育；⑤采用RTPCR检测孵育后CXCL16及CD36mRNA的表达量，观察和比较各组孵育后CXCL16及CD36 mRNA的表达情况. 结果： ①随着培养液中AGE浓度的增加CXCL16及CD36 mRNA的表达增加；②随培养液中葡萄糖浓度的增加CXCL16及CD36 mRNA的表达增加；③AGE及葡萄糖同时作用于THP1巨噬细胞时,对CXCL16及CD36 mRNA的表达上调作用大于AGE或葡萄糖单一因素的影响. 结论： AGE及葡萄糖呈时间和浓度依赖性上调THP1巨噬细胞CXCL16 mRNA的表达,并且AGE及葡萄糖两者合用可以进一步增加这种表达. 这可能为糖尿病动脉粥样硬化机制的探讨提供新的线索. 【关键词】 CXCL16；糖基化终产物，高级；葡萄糖；糖尿病 0引言 结合磷脂酰丝氨酸和氧化低密度脂蛋白（oxidized loa 公司；葡萄糖购自北京泛基诺科技有限公司；TRIzol及其它RNA提取试剂为Gibco公司产品；所有引物由上海生工公司合成；cDNA 合成酶（MMLV）及Taq酶购自北京天为时代公司；其他试剂均为进口或国产分析纯. 1.2方法 1.2.1THP1细胞株培养人单核细胞系THP1株购于中科院上海细胞生物所细胞中心. THP1细胞生长于含有低糖（5.6 mmol/L），100 mL/L 胎牛血清，10 mmol/L HEPES，1×105 U /L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640 完全培养基中，置于37℃，50 mL/L CO2 饱和湿度培养箱内培养. 1.2.2实验分组取对数生长期THP1细胞（1×106个/皿）进行实验，每次实验前用100 nmol/L PMA孵育THP1细胞48 h，使其诱导分化为巨噬细胞［6］. ①单独AGE处理组：首先确定合适的培养时间，即用100 mg/L AGE与THP1巨噬细胞孵育不同时间（0，6，12，24，48，72 h），根据培养结果，选择72 h为合适孵育时间，不同浓度的AGE（ 0，50，100，150 mg/L）与THP1巨噬细胞共同孵育72 h；②单独葡萄糖处理组：用高浓度葡萄糖培养液（30 mmol/L）与THP1巨噬细胞孵育不同时间（ 0，6，12，24，48，72，96 h），确定72 h为合适培养时间后，用不同浓度葡萄糖（5.6，10，20，30 mmol/L）与THP1巨噬细胞共同孵育72 h；③AGE和葡萄糖联合作用组：分别用AGE(100 mg/L)、高浓度葡萄糖（20 mmol/L）及同时加入AGE(100 mg/L)和葡萄糖（20 mmol/L）与THP 1巨噬细胞孵育72 h. 1.2.3逆转录 聚合酶链反应检测CXCL16及CD36 mRNA的表达TRIzol试剂提取细胞总RNA，cDNA反应总体系为20 μL：10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.1 mol/L DTT 1 μL，500 mg/L Random primer 0.25 μL，6.7×108 nkat/L RNasin 0.5 μL， 3.3×107 nkat/L MMLV 1 μL，5×缓冲液2.0 μL. 以cDNA为模板，分别使用下述3对引物进行PCR，扩增CXCL16基因的引物序列为：上游5′ACTCAGCCAGGCAATGGCAAC 3′，下游5′GGTATTAGAGTCAGGTGCCAC 3′，扩增片段长度为693 bp. 扩增CD36基因的引物序列为：上游5′CTCCCAAAGTGCTGGGATTA 3′，下游5′AGCCTTTGGGGGTCTTTCTA 3′，扩增片段长度为246 bp. 扩增内参照磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的引物序列为：上游5′CTGGTCACCAGGGCTGCTTTT 3′,下游5′CATGAGGTCCACCACCCTGTT3′,扩增片段长度为936 bp. PCR反应条件为：95℃ 5 min 预变性，95℃ 30 s 变性，60℃ 30 s 退火，72℃ 30 s延伸，30 个循环，72℃ 继续延伸10 min. PCR反应总体系为20 μL： 无RNA酶水14.75 μL，10×缓冲液