CTL前体频率对CD8+CTL应答类型的影响.docVIP

　　CTL前体频率对CD8+ CTL应答类型的影响 【摘要】 目的: 探讨CTL前体的频率对CTL应答类型的影响。方法: 用重组鼠IL4和GMCSF诱导小鼠骨髓DC发育成熟, 卵清蛋白Ⅰ（OVAⅠ）多肽激活DC, 流式细胞术（FCM）分析DCOVA表型; 用OVA特异CD8+ T细胞和DCOVA接种Iab-/- C57BL/6小鼠, FCM检测小鼠体内OVA特异性CTL及特异性CTL对OVA特异性脾细胞的体内细胞毒作用, 并观察DCOVA免疫后小鼠肺肿瘤的生长情况。结果: 经OVAⅠ多肽刺激后, DC表面有高水平CD11c、 CD80、 CD54、 Iab、 Kb分子及pMHCⅠ复合体表达; 注射不同剂量（0×106、 0.25×106、 0.5×106、 1×106、 5×106）OVA特异性CD8+ T细胞后, 小鼠外周血OVA特异CTL占CD8+ T细胞的百分比分别为0.01%、 1.31%±0.21%、 2.34%±0.17%、 3.11%±0.25%、 4.23%±0.32%, 注射CD8+ T细胞组OVA特异CTL百分比均较对照组明显增高（Plt;0.05）, 未接种CD8+ T细胞的野生型C57BL/6小鼠外周血OVA特异CTL为2.45%±0.22%; 各剂量组CFSEloin, OVA）特异的CD8+ T细胞, 探讨CTL前体频率对CTL免疫应答的Th细胞依赖性的影响。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 OVAⅠ多肽为SIINFEKL公司产品。FITC标记的抗鼠CD11c、 CD40、 CD80、 CD54、 Iab、 Kb和H2 Kb/OVAⅠ复合物（pMHCⅠ）抗体为Pharmingen公司产品。PE标记的抗鼠H2 Kb/ OVA257264抗体购自Beckman Coulter公司。重组鼠IL4和GMCSF为R＆D公司产品。荧光染料CFSE为Molecular Probes公司产品。MO4为转OVA基因的黑色素瘤细胞, 具有高度肺转移特性, 由本室保存。OVA特异的TCR转基因OTⅠ小鼠和野生型C57BL/6小鼠（B6; CD45.2+）、 Iab缺陷型（Iab-/-）C57BL/6小鼠（雌性, 体质量23～30 g, 6～8周龄）由Jackson实验室引进。 　　1.2 方法 　　1.2.1 小鼠骨髓DC的培养及激活 CO2窒息法处死小鼠, 无菌条件下取小鼠股骨、 胫骨, PBS冲洗骨髓至髓腔变白, 收集冲洗液, 1 500 g离心5 min, 收集细胞用PBS洗2次。TrisNH4Cl裂解红细胞, 用含20 μg/L GMCSF、 1 μg/L IL4的DMEM培养基重悬细胞至2×109/L, 按每孔4 mL加入24孔板, 置37℃、 50 mL/L CO2培养。第3天更换培养液,轻轻晃动培养板, 弃去上清, 补入含细胞因子的DMEM完全培养液。第6天细胞换液, 用吸管轻轻冲洗, 收集上清, 1 500 g离心5 min, 用含20 μg/L GMCSF、 1 μg/L IL4 和15 μg/L TNF的DMEM培养液重悬细胞, 继续培养24 h后收集细胞, 换无血清的AIMV培养液, 加入OVAⅠ多肽（0.3 g/L）, 置37℃、 50 mL/L CO2培养过夜, 次日收集细胞进行表型鉴定。 　　1.2.2 OVA特异性CD8+ T细胞的分离 CO2窒息法处死OTⅠ小鼠, 无菌分离脾脏, 置于盛有适量无菌PBS的小平皿中, 经200目钢网研磨, 制成单个细胞悬液。PBS洗2次。用 RPMI1640培养液重悬细胞, 加入尼龙毛柱中, 常规培养1 h, 收集流出的T淋巴细胞, PBS洗2次, 然后将细胞悬浮于PBS中, 采用免疫磁珠结合的抗CD4单克隆抗体（mAb）阴性选择法（按说明书进行操作）去除CD4+ T细胞, 富集CD8+ T细胞。 　　1.2.3 DC表型分析 收集经OVAⅠ刺激的骨髓细胞, 用PBS悬浮为1×109/L, 加入流式细胞术（FCM）测定管, 每管1 mL, PBS洗2次, 离心去上清后加入PBS 100 μL, 分别加入FITC标记的抗鼠CD11c、 CD40、 CD80、 CD54、 Iab、 Kb和pMHCⅠ抗体1 μL。混匀后于4℃避光孵育30 min, PBS 洗2 次, FCM分析。 　　1.2.4 CD8+ T细胞接种小鼠 OVA特异CD8+ T细胞以不同剂量（0×106、 0.25×106、 0.5×106、 1×106、 5×106）经尾静脉接种Iab-/-C57BL/6小鼠, 每个剂量组10只, 野生型C57BL/6小鼠作为对照未接种CD8+ T细胞, 第2天野生型及Iab-/-C57BL/6小鼠均尾