HMGB1对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬和IA-E表达的影响.docVIP

　　HMGB1对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬和IA/E表达的影响 【关键词】 高迁移率族蛋白B1 巨噬细胞 吞噬 IA抗原 IE抗原 　　新近研究发现,核内蛋白高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein, HMGB1）可由死亡细胞或活化单核/巨噬细胞释放至胞外, 发挥广泛促炎效应［1, 2］。因较TNFα、 IL1β等分泌延迟、 持续时间久,国内外学者将HMGB1称作“晚期”炎症介质［1, 3］。若拮抗HMGB1, 则脓毒症动物脏器功能改善, 生存率增加［4］。HMGB1能否影响单核/巨噬细胞其他功能, 如免疫防御、 免疫监视、 抗原提呈及免疫调节等, 其影响的程度及范围如何？ 这些问题尚待阐明。鉴于此, 我们将探讨HMGB1对体内外巨噬细胞吞噬和抗原提呈功能影响,为脓毒症HMGB1拮抗 治疗 方案提供免疫学证据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 DMEM(Hyclone)、 胎牛血清(特优级, Hyclone)、 多黏菌素B(Sigma)、 HMGB1(Sigma)、 0.72 g/L中性红溶液、 Hanks液、 细胞消化液(无钙镁Hanks液+2.5 g/L胰酶+0.2 g/L EDTA)、 细胞裂解液(冰醋酸与无水乙醇1∶1混合)。RPE标记抗IA/E及RPE标记同型对照、 FITC标记抗CD14、 抗FcγⅡ/Ⅲ受体抗体、 染色缓冲液, 购自BD/PharMingen公司。流式细胞分析仪（FACS/Calibur）为BectonDickinson产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 腹腔巨噬细胞的分离、 纯化 常规方法, 用DMEM (100 mL/L FCS)调整腹腔巨噬细胞密度为3×109/L, 备用。 　　1.2.2 体外试验分组 3×109/L巨噬细胞入96孔培养板, 0.1 mL/孔, 孵育2 h, 去未贴壁细胞, 加DMEM(100 mL/L FCS) 0.1 mL/孔, 多黏菌素B (7×106 U/L) 1 μL/孔, 以中和可能沾染内毒素。台盼蓝染色证实细胞活率gt;95%, 瑞氏染色证实巨噬细胞纯度gt;85%。再分为培养体系内HMGB1终浓度为0、 1、 10、 100、 1000、 5000 μg/L6个组, 每浓度3个平行孔, 分为0、 3、 6、 12、 24 h时相, 分别在培养终点前24、 18、 12、 0 h加入相应浓度HMGB1。重复试验3～4次。 　　1.2.3 体内试验分组 6周龄SPF级雄性BALB/c小鼠,随机分为生理盐水对照(NS)、 24 h高和低剂量HMGB1注射组［24 h(H)或24 h(L)］、 48 h高和低剂量HMGB1注射组［48 h(H)或48 h(L)］, 每组每个时相点4只。动物禁食过夜, 晨8∶00腹腔注射0.2 mg/L或20 mg/L HMGB1, 或生理盐水, 0.5 mL/只, 于20∶00再次腹腔注射0.2 mg/L或20 mg/L HMGB1, 或生理盐水, 0.5 mL/只。于相应时相点, 收集、 分离、 纯化腹腔巨噬细胞, 方法同前, DMEM培养液(100 mL/L FCS)调整至3×109/L, 部分用于检测巨噬细胞吞噬功能, 部分用于检测巨噬细胞IA/E表达。 　　1.2.4 指标检测 (1)巨噬细胞吞噬功能: 用DMEM培养液(100 mL/L FCS)调整收集的巨噬细胞至3×109/L, 0.1 mL/孔, 孵育4 h, 弃上清, 加0.72 g/L中性红溶液0.1 mL/孔, 继续孵育30 min, 弃中性红, 0.01 mol/L PBS洗4遍, 加细胞裂解液0.2 mL/孔, 37℃过夜。检测A540值。A540值大小用于反映巨噬细胞的吞噬能力强弱。(2)巨噬细胞IA/E表达: 收集培养或体内试验分离的腹腔巨噬细胞0.5×106～1.0×106, 经抗FcγⅡ/Ⅲ受体抗体1 μg处理。再加入FITC标记抗CD14及RPE标记抗IA/E或RPE标记同型对照, 4℃避光孵育30 min, 洗涤后10 g/L多聚甲醛重悬, 固定。采用流式细胞仪配套的CellQuest软件进行分析检测, 其中FITC、 RPE分别设在FL1、 FL2荧光通道上, 在CD14/SSC上根据CD14+设门, 每次获取门内10000个细胞。阴性对照为未染色全阴性对照和RPE标记同型对照。 　　1.2.5 统计学分析 在统计软件Stata 7.0上运行, 体外试验结果采用两因素方差分析和单因素方差分析及组间比较分析, 体内试验结果采用单因素方差分析和t检验。 　　2 结果 　　2.1 HMGB1对培养腹腔巨噬细胞吞噬功能影响 HMGB1刺激后6 h,