N糖基化修饰对突触细胞黏附分子SynCAM调节突触可塑性的影响.docVIP

　　N糖基化修饰对突触细胞黏附分子SynCAM调节突触可塑性的影响 【关键词】 SynCAM; N糖基化修饰; 突触后电活动 突触细胞黏附分子(SynCAM)是最近发现的大脑特异性表达的细胞黏附分子(CAM)[1], 属于免疫球蛋白超家族的一员, 主要是分布在突触前后膜作为同嗜黏附分子跨越突触间隙[2]。在大鼠实验中发现新出生大鼠脑中没有发现表达SynCAM蛋白, 但出生后3周内之一突触形成的重要时期表达量增加[3]。海马CA1区神经元内保持一定钙离子浓度是维持突触可塑性是必须条件[4]。SynCAM的引人之处在于其活动不仅局限于黏附, 而且是非钙依赖的, 同时还参与突触的融合和分化。研究发现SynCAM Ig样结构域对其调节作用影响重大, 而分析Ig样结构域发现存在N糖基化修饰位点, 并且SynCAM只受N糖基化修饰。由于N糖基化修饰在参与细胞与细胞黏附、 识别以及蛋白受体调节的细胞表面蛋白中发挥着重要作用, 因此我们通过定点突变造成SynCAM胞外Ig样结构域N糖基化修饰缺失, 转染海马神经元, 通过电生理试验观察海马神经元突触后电活动的差异, 进行N糖基化调节SynCAM突触功能的初步研究。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 孕15～16 d雌性SD大鼠由上海医科大学实验动物中心提供。DMEM/F12培养基、 EGF、 bFGF、 B27胎牛血清购自GIBCO公司。多聚赖氨酸, 2.5 g/L胰蛋白酶消化液、 Goat antirabbitFITC、 Donkey antiratTex、 DAPI 、 Triton X100和SynCAM/TSLC1购自sigma公司。dNTPS、 EcoR I和Xho I购自Promega公司。PCR试剂和Taq polymerase购自TaKaRa。纯化试剂盒、 小量抽提试剂盒、 凝胶回收试剂盒购于中科开瑞公司。大抽质粒试剂盒购自Qiagen。QuikChange SiteDirected Mutagenesis Kit购自Stratagene公司。磷酸钙共沉淀转染试剂盒购自北京博大泰恒技术公司。PNGase F试剂盒购自Seikagaku公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 原代海马神经元的分离培养 分离培养前晚上用多聚赖氨酸包被盖玻片, 无菌操作并备用。新生24 h的SD大鼠无菌条件下断头处死取全脑, Dhanks液洗数次; 分离海马组织, 置于冰浴的Dhanks液中, 充分剪碎组织; 加入同体积1.25 g/L的胰蛋白酶, 消化20 min左右; 胎牛血清终止消化, 轻轻吹打细胞数分钟, 150目网筛过滤, 收集细胞悬液; 以1 100 r/min离心5 min, 倾去上清, 用DMEM/F12培养液重悬细胞, 轻轻吹打, 计数, 调整细胞密度为(2～5)×103/cm2, 加入终浓度为100 mL/L胎牛血清后接种于放有盖玻片的培养皿中, 置于37℃、 含50 mL/L CO2培养箱中培养; 12 h内禁止晃动。接种后24 h将培养液全量换成无血清DMEM/F12培养液, 至48 h时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞苷, 以抑制非神经元细胞的过度生长, 随后每3 d半量换液。 　　1.2.2 星形胶质细胞的培养纯化 P3 SD大鼠低温麻醉后乙醇消毒, 无菌操作下取大脑皮层并除去脑膜, 剪碎组织, 加入1.25 g/L胰酶消化20 min, 用滴管吸出组织转移到装有冷的含100 mL/L FBS MEM的离心管内终止胰酶作用5 min, 吸出组织转移到另一支装有冷的100 mL/L FBS MEM的离心管内, 吹打数次, 静置后取上清并吸到另一支离心管内, 重复上述步骤2次或3次, 所得上清于800 r/min离心5 min, 弃上清, 管内加入新鲜100 mL/L FBS MEM并吹打成单细胞悬液, 细胞计数, 调整细胞密度培养, 每隔2～3 d进行全量换液, 第9日换液后放入孵箱24 h, 于37℃恒温摇床上280 r/min 18 h。吸去悬液, DHanks液洗2次后常规传代, 种入12孔培养板。 　　1.2.3 SynCAM糖基化位点突变质粒构建及鉴定 利用SynCAM全长基因作为模板, 对糖基化位点104位、 116位、 168位和311位存在N糖基化修饰位点, 内含引入的点突变核苷酸序列。PCR反应体系为: 50 (灭菌水34.5 μL, 10×Buffer 5 μL, 10 mmol/L dNTP 4 μL, 纯化回收的两个片段各2 μL, 83.35 nkat高保真Taq酶0.5 μL), 反应条件为: 94℃ 预变性5 min, 94℃变性l min, 48℃退火2 min, 72℃延伸2 min,