PC12细胞转染nNOSα和nNOSβ对NFkappaB转录活性和细胞凋亡的影响.docVIP

　　PC12细胞转染nNOSα和nNOSβ对NF kappa B转录活性和细胞凋亡的影响 【摘要】 目的： 比较转染nNOSα和nNOSβ的PC12细胞NFkappa B转录活性和细胞凋亡百分数，探讨nNOSα和nNOSβ在功能上的差异性. 方法： 将携带nNOSα和nNOSβ基因的pcDNA3.0表达质粒转化感受态细胞，在大肠杆菌中扩增后，提纯质粒酶切鉴定. nNOSα和nNOSβ基因的pcDNA3.0表达质粒通过脂质体转染PC12细胞，G418筛选，使用抗nNOS羧基端的抗体，通过免疫组织化学和SA）检测细胞核NFkappa B转录活性. 不同PC12细胞经PI染色后流式细胞仪分选，测定不同增殖周期的细胞数. 结果： 质粒酶切鉴定结果与携带nNOSα和nNOSβ基因的pcDNA3.0质粒结构相符；免疫组织化学和: To determine the effects of overexpression of nNOSα and nNOSβ on NFkappa B activity and apoptosis in PC12 cells. METHODS: The expression vectors of pcDNA3nNOSα and pcDNA3nNOSβ ation process. The vectors it. Then PC12 cells munohistochemistry and SA). The percentage of subG1/G0 ined by floetry(FCM) iodide(PI). RESULTS: The number and size of digested products in gel eletrophoresis munohistochemistry and 2000购自美国Invitrogen公司； DMEM/F12培养基、抗nNOS抗体购自北京中山公司；Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents试剂盒购自美国Pierce生物技术公司；新霉素类似物G418, NFkappa B结合系列5′AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C3′(双链) ，碘化丙啶PI染料购自美国Sigma公司. 　　1.2方法 　　1.2.1转化扩增使用大肠杆菌与CaCl2在冰上共孵育制备感受态细胞，通过热休克的方式将携带nNOSα和nNOSβ基因的pcDNA3.0质粒转化感受态细胞，氨苄青霉素筛选后，在培养基LB中大量扩增. 　　1.2.2酶切鉴定小量抽提（碱裂解法）质粒，内切酶HindⅢ 酶切带nNOSα和nNOSβ基因的pcDNA3.0质粒，酶切产物加样于10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯下观察结果，并拍照分析. 　　1.2.3PC12细胞的转染及筛选PC12细胞采用DMEM/F12培养基,150 g/L胎牛血清于多聚赖氨酸包被的培养瓶中培养. 在PC12细胞覆盖培养瓶达到90％左右时，使用脂质体将携带nNOSα和nNOSβ基因的pcDNA3.0质粒分别转染PC12细胞，培养1～2 d后，经G418筛选2~3 ol/L PBS洗净，无水甲醇固定. 经羊血清封闭后，依次加入抗nNOS抗体（北京中山公司）、生物素标记的抗兔二抗、亲和素和过氧化物酶复合物，DAB显色，检测nNOS的表达. 苏木素复染后，脱水、透明和封片. 　　1.2.5筛选后PC12细胞胞浆和核蛋白的提取收集未转染、转染nNOSα和nNOSβ基因的PC12细胞，1500 r/min离心后，使用Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents试剂盒分别提取细胞浆蛋白和细胞核蛋白，考马斯亮蓝G250法蛋白定量，-80℃储存备用. 　　1.2.6SA）［8-10］分别取未转染、转染nNOSα和nNOSβ基因的PC12细胞细胞核蛋白20 μg，分别与 ［γ32］P标记的NFkappa B结合系列5′AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C3′(双链)共孵育1 h. 灌制20 g/L SDSPAGE凝胶，分别加入上述混合物，在溴酚蓝指示下150 V电泳. 电泳完成后，应用同样大小的滤纸贴附在凝胶上，小心剥离凝胶，将滤纸和凝胶一同干燥，让滤纸完全干在滤纸上，把滤纸和X光片一起置于-70℃下12 h以获得放射性自显影影像. 　　1.2.8凋亡细胞比例的测定收集未转染、转染nNOSα和nNOSβ基因的PC12细胞，700 ml/L的乙醇固定后，加入PI染料孵育，PBS洗净后，在流式细胞仪下根据荧光强度检测不同DNA含量的细胞数量［8-9］，分析三种细胞凋亡细胞的比例. 　　统计学分