QLFATINSTL(93-102aa)是隐球菌抗原MP98CTL优势表位.docVIP

　　QLFATINSTL(93?102aa)是隐球菌抗原MP98 CTL优势表位 谷明莉，邓安梅，周晔，陈燕，陈波，仲人前，温海，陈孙孝 【摘要】 目的 鉴定隐球菌抗原MP98中的HLA?A*0201限制性CD8+CTL表位。方法 应用数据库SYFPEITHI预测隐球菌MP98中可能存在的HLA?A*0201限制性CD8+CTL表位，经流式细胞术分析各抗原肽与HLA?A*0201的亲合力，经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞(PBMCs)对各抗原肽产生的增殖反应，经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性，逐步鉴定MP98的HLA?A*0201限制性CD8+CTL表位。结果 位于MP98氨基酸序列肽3(93?102aa)与HLA?A*0201分子具有较高的亲合力，并都能刺激HLA?A*0201阳性个体PBMC增殖，并诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL。结论 肽3 QLFATINSTL(93?102aa)是抗原MP98上HLA?A*0201限制性CD8+CTL的优势表位，可作为隐球菌疫苗设计的候选表位。 【关键词】 隐球菌；细胞毒性T细胞；抗原表位 　　Abstract： Objective To identify HLA?A*0201 restricted CD8+CTL epitopes in Cryptococcus neoformans MP98.Methods Firstly, database SYFPEITHI ans MP98. Secondly, affinity and stability of the predicted peptides olecules, and stimulated PBMCs in healthy donors to proliferate and induce antigen specific CTLs. Only peptide 6 could give a positive proliferation response and specific cytotoxicity. Conclusion Peptide 3 (QLFATINSTL, 93?102aa) is the HLA?A*0201 restricted CD8+CTL epitope of Cryptococcus neoformans MP98, ans; epitope; cytotoxic T lymphocyte 　　近年来，隐球菌性脑膜炎的发病率呈明显上升趋势。尤易伴发于HIV/AIDS等免疫缺陷患者。该病治疗困难，治愈率低，已成为这类人群致死的主要原因之一[1～2]。在隐球菌感染的人群中只有免疫力功能较为低下的个体才易于发病，而在机体隐球菌感染中越来越多的研究表明，特异性细胞免疫发挥着重要作用。因此，开发研制新的预防和治疗隐球菌的疫苗，具有重要意义和广泛的应用前景[3]。HLA?A*0201在多数人群中普遍存在，其频率gt;40%，进行HLA?A*0201限制性CTL表位的研究将更具有现实意义。 　　本课题利用生物信息学数据库对隐球菌抗原MP98[4]中可能存在的HLA?A*0201限制性CD8+CTL表位进行初步预测，然后进行抗原肽?HLA分子亲合力和稳定性分析，采用时间分辨荧光法(DELIFA)对抗原肽诱导的细胞增殖反应、CTL细胞毒活性进行研究，逐步鉴定出QLFATINSTL(93?102aa)是隐球菌抗原MP98 CTL优势表位。 　　1 材料和方法 　　1.1 研究对象 10例HLA?A*0201阳性健康志愿者，10例HLA?A*0201阴性健康志愿者，留取外周血10 ml，肝素抗凝。 　　1．2 试剂和材料 RNA抽提试剂盒购自Qiagen公司；LPS、人重组IL?2、DMSO、BFA、β2?mg 均购自Sigma公司；淋巴细胞分离液LymphoprepTM购自挪威AXIS?SHELD公司；人重组GM?CSF、人重组IL?4购自RD公司；FITC标记的抗?CD3、抗?CD8、抗?HLA．A2流式单克隆抗体均为Caltag公司产品；RPMI1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司；时间分辨荧光DELFLA细胞增殖(AD0200)与细胞毒性(AD0116)检测试剂盒均购自Perkin Elmer公司；多肽由上海生工生物工程技术有限公司合成；T 2细胞株由上海长征医院临床实验诊断科保存。 　　1．3 主要仪器 流式细胞仪(Coulter EPICS XL)；时间分辨荧光检测仪(DELFIA 1235，Perkin Elmer)。 　　1．4 HLA分型 先以鼠抗人HLA?A2单克隆抗体(BB7．2)进行HLA?A2流式初步筛选，然后再以HLA?A2高分辨SSP?PC