RNAi沉默VEGF表达对大肠癌细胞肝转移的影响.docVIP

　　RNAi沉默VEGF表达对大肠癌细胞肝转移的影响 ：王崇强， 范钰， 徐永中， 庞利群 【摘要】 目的： 研究血管内皮生长因子（vascular endothelial groRNA设计合成小干扰RNA，采用荧光实时定量PCR检测VEGF mRNA水平，分别以软琼脂集落培养试验和Boyden模型观察癌细胞锚着不依赖性增殖和癌细胞侵袭能力。以脾切除法建立大肠癌肝转移模型，以不同方法处理的癌细胞接种模型，观察对大肠癌细胞肝转移的影响。结果： 转染组VEGF基因mRNA水平明显降低，且呈浓度和时间依赖性。经VEGF siRNA转染处理的癌细胞软琼脂集落形成数和穿膜细胞数明显减少，且呈浓度依赖性（Plt;0.05，Plt;0.05）。体内试验发现，对照组10只全部出现大肠癌肝转移灶，而siRNA组仅仅1只出现肝转移，差异具有显著统计学意义（Plt;0.01）。结论： VEGF基因在大肠癌肝转移中起着重要的作用；以RNAi技术沉默VEGF基因表达，可抑制大肠癌细胞肝转移。 【关键词】 肠肿瘤；　 肝转移； 血管内皮生长因子； RNA干扰 　　［Abstract］ Objective: To study the effects of vascular endothelial groetastasis of colon cancer. Methods： After human colon cancer cell line LS174T all interfering RNA（siRNA）, the mRNA level ined by real time RTPCR.The anchorageindependent groined using clone formation in soft agar,and invasion ability ber model. Thirty nude mice model of colorectal cancer live rmetastasis y. Results： VEGF siRNA can inhibit anchorageindependent groetastasis of colon cancer in vivo. Conclusion： VEGF siRNA can inhibit liver metastasis of colon cancer. 　　［Key a； liver metastasis；　vascular endothelial groall interfering RNA，siRNA）介导的RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术，采用VEGF基因siRNA转染处理大肠癌细胞LS174T，从体内外观察了对癌细胞侵袭和肝转移的影响。 现报告如下。 　　 1 材料与方法 　　1.1 材 料 　　人大肠癌低分化腺癌细胞株LS174T由 中国 科学 院上海细胞所细胞库从美国ATCC引进并提供，肿瘤细胞常规在含体积分数为10%胎牛血清RPMI1640培养液中培养。针对VEGF siRNA的正义链为：5′GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTdT 3′。错配siRNA序列（正义链：5′UUCUCCGAACGUGUCACGUTdTd3′；反义链：5′ACGUGACACGUUCGGAGAATdTdT3′）。均由美国Dharmacon公司合成。Trizol,RNase inhibitor、反转录酶SSRTⅡ,Taq酶和转染试剂Oligofectamine购自美国Invitrogen公司。Balb/c裸鼠，30只，雌性，4周龄，体质量约14～18 g，购自中国科学院上海生物化学研究所，于无特殊病原体条件(SPF)下饲养。 　　1.2 细胞培养及转染处理 　　大肠癌LS174T细胞在含10％胎牛血清的RBMI1640培养液，37℃,5％CO2、饱和湿度条件下连续培养。转染前1天，将1.0×105对数期生长的细胞接种于24孔培养板，1 ml/孔，培养过夜。次日进行转染。基本操作按说明书进行。分组：(1)空白对照组(ConA)，即未经任何处理的癌细胞；(2)空载对照组(ConB)，即单一用脂质体处理的对照组；(3)错配对照组(ScrRNA)；(4)siRNA转染组：含10％胎牛血清的RBMI1640中含的已用脂质体包埋的siRNA(3.125,6.25和12.5 nmol/L)。转染后于不同时间采用胰酶消化收取细胞，进行以下试验。 　　1.3 实时定量RTPCR检测VEGF mRNA水平 　　收集细胞，以Trizol抽提细胞总RNA，取总RNA 1 μg，以oligo dT（15 mer）为引物反转录合成