RNA干扰沉默STAT3基因表达对人大肠癌细胞生物学行为的影响.docVIP

　　RNA干扰沉默STAT3基因表达对人大肠癌细胞生物学行为的影响 ：孙海波 李静 安鼎伟 陈丽 张照果 【摘要】 目的 探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默STAT3基因表达对人大肠癌细胞生物学行为的影响。方法 采用真核细胞转染技术将pSilencer 3.0H1siRNASTAT3重组质粒转染人结肠癌HCT116细胞，MTT法检测细胞增殖，RTPCR、DM、胎牛血清购自Gibco公司，常规试剂由辽宁医学院科学实验中心提供。pSilencer1.0U6STAT3siRNAGFP重组质粒由本室保存，超纯质粒小样快速提取试剂盒(去内毒素)购于EZNA公司，质粒提取按说明书进行，经λDNA定量0.5 g/L者待用。 　　1.2 方法 　　1.2.1 MTT法 取对数生长期细胞，转染前1 h，0.25%胰酶消化后，含10%胎牛血清的IMEM培养基终止消化，收集备用。实验分为空白组(M)，pSH1SiScramble组(N)，pSH1SiSTAT3组(T)，T组再按质粒浓度分为T1、T2、T3。每组分24 h、48 h、72 h三个时间段，每时间段 4复孔。各组质粒分别取：N组0.8 μg，T1组0.6 μg，T2组0.8 μg，T3组1.2 μg加染试剂2.0 μl，于24 h、48 h、72 h相差显微镜下观察拍照后，各孔加入5 g/L的MTT 20 μl，孵育4 h，弃上清，每孔加入分析纯DMSO 100 μl，震荡10 min，酶标仪检测各孔吸光度值(A570)， 计算 细胞生长抑制率。实验共重复3次。细胞生长抑制率(%)=(1-实验组/对照组)×100%。 　　1.2.2 细胞转染 转染前1 h，按上述方法收集细胞备用。实验分为M、N、T共3组。将转染试剂5.0 μl溶于终体积IMDM(17.7 g/L)100 μl，混匀后制成A液，室温孵化10 min;各组质粒分别取3.0 μg溶于IMDM(17.7 g/L)100 μl，混匀后制成B液;将A液加入B液，混匀后制成C液，室温孵化10 min。分配C液200 μl到6孔板各孔中，调细胞浓度为2×105/孔。转染后72 h，相差显微镜观察细胞生长情况后进行后续实验。 　　1.2.3 RT-PCR 收获的细胞按说明书完成RNA提取，取总RNA 10 μg逆转录为cDNA，PCR条件:94℃，5 min;94℃，30 s;56℃，30 s;72℃，45 s;72℃，7 min，30循环，25 μl体系，以βactin为内参。PCR产物以20 g/L琼脂糖凝胶电泳，Gene genius凝胶成像系统分析后，以STAT3/βactin产物量的比值为最终结果。实验重复3次。引物序列:STAT3：正向5′TTGCCAGTTGTGGTGATC3′，反向5′AGACCCAGAAGGAGAAGC3′;βactin:正向5′AAGTACTCCGTGTGGATCGG3′，反向5′ATGCTATCACCTCCCCTGTG3′。 　　1.2.4 、N、T共3组转染于6孔板内，72 h后取出盖玻片，荧光显微镜下观察拍照后用40 g/L多聚甲醛固定30 min， PBS洗3次，蒸馏水洗3次，TritonX 100(0.3%)洗10 min，PBS洗5 min×3次，其余步骤按免疫组织化学染色说明书操作。阳性结果为细胞质或胞核棕黄着色，随机选取5个高倍镜视野，计数阳性细胞占所研究细胞的15%以上即为阳性。 　　1.2.6 流式细胞术(FCM) 取转染48 h后的细胞1×106个，离心后用冷PBS悬浮，1 000 r/min离心10 min，清洗2遍，弃上清，将细胞用1 ml注射器快速推入700 ml/L冷乙醇中，4℃固定12 h以上。PBS洗2次，调细胞密度为1×109/L，RNase消化后，加入50 mg/L 1.5 ml PI染液。混匀后上流式细胞仪做单参数分析，计算各期细胞所占比例，实验共重复3次。 　　1.2.7 AO/EB双染色 取转染72 h后的细胞，制成悬液并调细胞密度为1×1010/L，取20 μl加100 mg AO染液2 μl及100 mg EB染液2 μl，滴于载玻片，盖片封片后荧光显微镜直接观察，于20 min内计数500个细胞。 　　1.3 统计学处理 应用SPSS13.0软件行相关数据分析，计量资料采用x±s表示;两组均数的比较用t检验。 　　2.2 HCT116细胞STAT3表达 RTPCR结果显示，T组STAT3基因的mRNA表达明显降低，STAT3产物量/βactin的比值分别为0.866±0.03、0.853±0.02、0.453±0.03，T组与M组、N组相比均有统计学意义(Plt;0.05)，见图1。组及N组胞浆和/