siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响.docVIP

　　siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响 ：李大可 ,彭芝兰 ,周斌兵 【摘要】 目的: 观察HPV16 E6 siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响。方法： 利用脂质体将HPV16 E6特异性siRNA表达载体转染Caski细胞，通过荧光定量RTPCR检测E6 mRNA的变化，流式细胞仪检测E6蛋白和细胞凋亡率的变化，MTT法和细胞克隆法检测细胞增殖的变化。结果： HPV16 E6 siRNA表达载体可明显抑制Caski细胞E6 mRNA和E6蛋白的表达，抑制率分别为89.5％和98.1％；表达载体可明显增加细胞凋亡率，抑制细胞的增殖和克隆的形成。结论： HPV16 E6 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌Caski细胞E6基因的表达，增加细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞增殖和克隆的形成。 【关键词】 siRNA表达载体； 宫颈癌； 细胞增殖； 凋亡 研究表明，人乳头瘤病毒(HPV) 16型E6 基因在宫颈癌的发生 发展 及恶性表型的维持中起着至关重要的作用，因此它已成为宫颈癌基因 治疗 的理想靶点之一。RNA干扰(RNAi)技术是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法［12］ 。已有研究证实，化学合成的小干扰RNA (siRNA) 能有效地抑制目的基因的表达，但作用持续时间短，而siRNA表达载体的方法可能延长作用持续时间［3］。本研究拟通过载体介导的RNAi技术来封闭宫颈癌Caski细胞E6基因的表达，观察HPV16 E6 siRNA表达载体对Caski细胞增殖的影响。 1 材料和方法 1.1 细胞转染 Caski细胞为HPV16阳性的宫颈癌细胞株，购自武汉大学典型物培养保藏中心。在研究中用脂质体法将HPV16 E6特异性siRNA表达载体E62(由第一所在实验室设计构建保存)［4］和空载体P0转染Caski细胞，通过G418(1 500 μg·ml-1)抗性筛选，至空白对照细胞完全死亡后，降低G418为750 μg·ml-1，转染后14 d得到抗性克隆细胞，分别命名为Caski E62、Caski P0。收集抗性克隆形成后1周的细胞。 1.2 荧光定量RTPCR检测HPV16 E6 mRNA的表达1.2.1 细胞总RNA的提取及逆转录 操作参照试剂盒[TrizolTMRNA Isolation Reagent(GIBCO)和RevertA idTM First Strand cDNA synthesis Kit(MBI)]说明书进行。 1.2.2 荧光定量RTPCR扩增 实验设Caski组（空白对照组）、Caski P0组（空质粒转染组）、Caski E62组3组，每项检测重复3次，取平均值。为避免收集细胞和实验过程中RNA的降解、所收集细胞数量的差异以及实验过程中操作带来的误差， 计算 时用细胞中表达恒定的看家基因GAPDH(3磷酸甘油醛脱氢酶)逆转录扩增产物量的CT值来校正HPV16 E6 mRNA表达变化。HPV16 E6上游引物为5′GAATGTGTGTACT GCAAGCA3′，下游引物为5′CACAGTGGCTTTTGACA GTT3′，TAQman探针为5′CAGCATATGGATTCCCATC TC3′。GAPDH上游引物为5′TGGGTGTGAACCACG AGAA3′，下游引物为5′ GGCATGGACTGTGGTCAT GA3′，探针为5′CTGCACCACCAACTGCTTAGC3′。其中探针于5′端标记荧光发光基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。在荧光定量PCR仪上进行PCR，扩增条件如下: 94 ℃ 1 min；94 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，45个循环；55 ℃ 30 s。从PCR动力学曲线读取荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数CT值。 1.2.3 荧光定量RTPCR结果计算 参照 文献 ［5］报道的比较阈值法。从各样品荧光定量PCR动力学曲线中判读其Ct值，用处理组样本基因的Ct值减去处理组参照基因的Ct值，得到ΔCt1，同样，用对照组样本基因的Ct值减去对照组参照基因的Ct值，得到ΔCt2，再用ΔCt1减去ΔCt2，得到ΔΔCt，即ΔΔCt＝ΔCt1-ΔCt2。处理组样本基因相对于对照组样本基因的量通过公式：处理组样本基因/对照组样本基因=EX-ΔΔCt 。抑制率=（1-EX-ΔΔCt）×100％。 1.3 流式细胞仪检测HPV16 E6蛋白的表达 流式细胞仪由四川大学人类疾病生物治疗实验室提供。流式细胞术检测阴性对照组、Caski组、Caski P0组、Caski E