SPTATApoptin融合蛋白对HepG2细胞周期的影响.docVIP

　　SPTATApoptin融合蛋白对HepG2细胞周期的影响 ：韩苏夏, 马瑾璐, 吕毅, 黄辰, 段康民 【摘要】 目的: 研究SPTATApoptin融合基因诱导人肝癌HepG2细胞凋亡和细胞周期阻滞, 探讨其用于肝癌 治疗 的可能性。方法: 通过DNA重组技术, 以pcDNA3.1/Apoptin质粒11为模板, 构建SPTATApoptin融合基因 plenti6V5DTOPO真核表达载体。用SPTATApoptinplenti6V5DTOPO真核表达载体转染 中国 仓鼠卵巢细胞（CHO）, 转染后Blasticidin霉素进行筛选, 并进行鉴定得到稳定表达SPTATApoptin的CHO细胞株。收集含有TATApoptin融合蛋白的筛选细胞培养上清, 用于HepG2细胞培养。于共培养后的不同时段收集HepG2细胞, 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡和细胞周期。结果: 用包含SPTATApoptin融合基因的plenti6V5DTOPO真核表达载体瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）, 成功筛选出稳定表达SPTATApoptin融合蛋白的CHO细胞, 收集细胞培养上清, 继续用于HepG2细胞培养, 可观察到HepG2细胞阻滞于G1期并引起细胞凋亡。结论: SPTATApoptin融合表达可引起HepG2细胞的细胞周期G1期阻滞。 【关键词】 信号肽; 蛋白转导域; 鸡贫血病毒; Apoptin蛋白; 肝癌 二十世纪九十年代早期, 人们发现由鸡贫血病毒(Chicken anemia virus, CAV)的一种小蛋白VP3（Apoptin）能够诱导人转化细胞和肿瘤细胞凋亡, 但对正常的人二倍体细胞无凋亡诱导作用［1］。 Apoptin的肿瘤细胞特异性可能与其在细胞中的亚细胞定位有关, 在转化或肿瘤细胞中Apoptin定位于细胞核, 而在正常细胞中定位于细胞质。Apoptin诱导的细胞凋亡不依赖p53, 且不为Bcl2、 BclxL的过表达所抑制。Apoptin此种特性向我们展示了其在肿瘤治疗领域诱人前景［2］。但是使用传统的转染方法转染并表达活性肽, 因受到转导效率和表达细胞的自杀死亡的限制, 难达到有效治疗实体瘤的目的。HIVTAT是近年来发现的一种新型的高效运输载体蛋白质转导结构 （protein transductIon domains, PTDs） 或称细胞穿膜肽（cell perating peptides, CPP）。HIVTAT能穿透细胞膜、 细胞核膜, 携带肽、 蛋白质和 DNA 分子等进入胞质和胞核发挥生物效应, 具有高效性、 无须耗能或通过受体转运的特点, 为提高靶细胞在体内外的基因转移效率和蛋白质表达提供了一个高效、 简便的方法［3］。目前的体内及体外试验显示HIVTAT可以穿过包括神经元细胞在内的所有组织细胞, 且未观察到明显毒副作用［4］。我们构建了带有分泌信号肽、 蛋白转导结构域的融合基因SPTATApoptin从而实现转染细胞转染后的分泌表达TATApoptin融合蛋白的表达方式, 可使融合蛋白进入未转染的肿瘤细胞。希望通过以上设计来实现对肝癌等实体瘤安全有效的特异性治疗。1 材料和方法 1.1 材料 大肠杆菌DH5α、 TOPO10B菌种为西北大学生命 科学 院分子微生物实验室保存; 质粒pLenti6/V5DirectionalTOPO和大肠杆菌Shot Stbl3TM购买于美国Invitrogen公司; 质粒pcDNA3.1(+)/Apoptin［5］为中国军事医学科学院放射医学学研究所孙志贤研究员惠赠。HepG2肝癌细胞系、 CHO(中国仓鼠卵巢细胞)购买于中国科学院上海细胞库。细胞培养于含有10 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培养基中。LipofectamineTM2000脂质体和AntiV5FITC单克隆抗体（mAb）购买于美国Invitrogen公司。 1.2 方法 1.2.1 SPTATApoptin融合基因真核表达载体的构建 登陆GenBank拷贝鸡贫血病毒, CAV（NC_001427）序列。应用Invitrogen公司生物软件（Vector NTI Advance 9）, 选取Apoptin基因序列（bp 486～852）; 根据 文献 选取分泌信号肽（signal peptide, SP）序列［6］和TAT的氨基酸序列和核苷酸序列［7］。根据以上序列设计PCR引物: primer1: 5′GTGTGGGCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAATGAACGCTCTG CAGGAAGATACTCC3′; primer2: