SV40大T抗原对人皮肤成纤维细胞生物学行为的影响.docVIP

　　SV40大T抗原对人皮肤成纤维细胞生物学行为的影响 ：王新文，金岩，刘源，王军琳，赵宇，董蕊 【关键词】 大T抗原 　　【Abstract】 AIM： To investigate the role of SV40 large T (LT) antigen on human skin fibroblasts transformation and to observe the biological alteration of the cells. METHODS： Human skin firbroblasts id psv3neo RNA and phenotypical changes of the transformants ined. RESULTS： LT cDNA transformed cell colonies RNA expressed in most transformed cells ined by in situ hybridization. After a period of time, hoal human skin fibroblasts immortalized is limited. So it is impossible to establish immortalized human skin fibroblast cell line only by large T. 　　【KeyRNA在转染细胞胞质中表达. 免疫组化结果显示，细胞质中有SV40大T抗原表达. 细胞计数、BrdU、流式细胞仪检测表明，经过一段时间的旺盛生长，在转染后第16代，细胞即进入危机期，以一种比衰老细胞更快的速度死亡. 结论: LT 可以促进正常皮肤成纤维细胞增殖，但这种能力是有限的，在转染后期甚至会促进细胞死亡. 所以要使人的正常皮肤成纤维细胞永生化，单纯利用LT的转染是不够的，还需要结合其它的转化方式. 　　【关键词】 SV40；大T抗原；皮肤；成纤维细胞 　　0引言 　　成纤维细胞是皮肤真皮部分的主要细胞成分，对皮肤起营养、支持和免疫作用. 皮肤成纤维细胞作为正常体细胞的一种，生命期有限，通常在40代左右即出现衰老［１］，继而增殖缓慢，逐渐死亡. LT cDNA的转染一直是非造血细胞永生化最常用的方法. 为获得性状稳定、能够长期培养的皮肤成纤维细胞，更好地满足基础研究和相关疾病的治疗，我们准备利用LT能使细胞向永生化趋势转变的特点，应用基因转染技术，研究LT对人皮肤成纤维细胞体外转化作用以及转化后细胞生物学特性的改变. 　　1材料和方法 　　1.1材料含有LT cDNA的质粒(psv3neo由Berg教授惠赠),皮肤组织(流产胎儿背部),DMEM培养基、胎牛血清(Gibco),Lipofect AMINE 2000 Reagent 转染试剂盒(Invitrogen),Biotek凝胶回收试剂盒(Omega),原位杂交标记和检测试剂盒(Boehringer Mannheim),SV40大T抗原抗体(Santa Cruz),免疫组化检测试剂盒(DAKO),BrdU检测试剂盒(Sigma), EcoRⅠ和PvuⅡ内切酶(Promega). 　　1.2方法 　　1.2.1细胞培养参照鄂征［２］所描述的方法，将真皮成纤维细胞制成细胞悬液后，离心.用含有100 mＬ#12539;L-1胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，按（2～4）×107#12539;L-1细胞密度将成纤维细胞接种到上述培养基中.12 h后换1次液体，以后3 d换1次液体，观察细胞形态. 细胞长到80%后，用2.5 g#12539;L-1胰酶消化，按14传代. 　　1.2.2质粒转染及细胞克隆的分离将传至第16代的皮肤成纤维细胞，接种到6孔板，每孔细胞数为2×105 .次日进行转染（转染过程按说明书进行）.转染后培养24 h，细胞接近汇合时，按110 密度传代，继续培养.待密度接近50％-70％时，加0.4 g#12539;L-1的G418进行筛选，未转染细胞作为对照.6 d后，对照细胞全部死亡，将筛选液浓度降至0.2 g#12539;L-1，2~3 RNA表达检测 EcoRⅠ／PvuⅡ双酶切质粒psv3neo后，10 g#12539;L-1琼脂糖凝胶电泳后，分离片段，用凝胶回收试剂盒，获得4.8 kb大小的LT cDNA，用随机引物法对该片段进行标记. 取转染后第3代和第16代细胞爬片，进行原位杂交，检测LT mRNA的表达情况.正常细胞作为阴性对照. 　　1.2.4SV40大T抗原检测取转染后第3代细胞爬片，利用免疫组化SABC法进行SV40大T抗原表达检测.步骤按说明书进行. 　　1.2.5细胞生长曲线分别取第3，19，