Synphilin1寡核苷酸对帕金森病酪氨酸羟化酶表达的影响.docVIP

　　Synphilin1寡核苷酸对帕金森病酪氨酸羟化酶表达的影响 【摘要】 目的 探讨Synphilin1对帕金森病（PD）酪氨酸羟化酶（TH）表达的影响。方法 50只SD大鼠随机分成5组，每组10只。PD组大鼠右侧黑质注入6羟多巴3 μL制作PD模型，反义组、同义组、错义组分别注入Synphilin1反义寡核苷酸、同义寡核苷酸、错义寡核苷酸各3 μL， 正常对照组右侧黑质注入2 g/L抗坏血酸生理盐水。取鼠的术侧脑黑质制作切片，利用免疫组化方法检测Synphilin1表达，利用免疫组化、ethodsFifty healthy male SpragueDaodels ade by unilateral stereotaxic infusion of 3 μL of 6hydroxydopamine (6OHDA) in right substantia nigra. Antisense group, sense group and missense group issense oligonucleotides respectively. Control group: natrium saline munohistochemistry, and expression of TH protein and mRNA immunohistochemistry, RNA in antisense group significantly increased. ConclusionSynphilin1 may affect the pathogenesis of PD by affecting the TH expression. ［KEY onooxygenase; Parkinson disease; rats 帕金森病（PD）是遗传易感性和环境因素共同作用的结果，其主要的病理改变是黑质LeL/kg体质量）腹腔注射麻醉大鼠，参照鼠脑立体定向图谱［5］，将大鼠固定在脑立体定向仪上，剪去头顶部毛，局部消毒，在正中从前向后切开大鼠头顶皮肤，分离颅骨表面的软组织，暴露右侧顶骨。以前囟为坐标原点，对右侧黑质定位，其坐标为：前囟后5.0 mm,矢状缝右侧1.5 mm,颅骨骨面下8.8 mm。PD组右侧黑质用微量注射器注入6羟多巴（6OHDA）18 μg（3 μL）,注射速度为1 μL /min, 术毕留针10 min。反义组连续2 d注入Synphilin1反义寡核苷酸3 μL,第3天注入6OHDA 3 μL；错义组注入Synphilin1错义寡核苷酸代替反义寡核苷酸；正义组注入Synphilin1正义寡核苷酸代替反义寡核苷酸；正常对照组黑质内注入2 g/L抗坏血酸生理盐水混合液3 μL。各组均在术后第4周采用100 g/L水合氯醛（5 mL/kg体质量）腹腔注射麻醉，快速断头取脑，切除右侧中脑腹侧制作标本，冷冻，切片。 1.2 实验方法 1.2.1 Synphilin1寡核苷酸(ODN)的设计和合成参照Genbank提供的大鼠Synphilin1 mRNA序列，设计了跨越Synphilin1 mRNA翻译起始区和编码区的两条反义寡核苷酸，分别为Antisense 1(AS1)：5′TCAGGGGCTTCCATTATTCT3′, Antisense 2(AS2)：5′GGGATGGTCTTGAGAGAGGT3′，经PCRDESN软件分析两条反义寡核苷酸之间无发夹结构、互补结构。同时设计相应的正义寡核苷酸和错义寡核苷酸作为对照，序列分别如下。正义：5′AGAATAATGGAAGCCCCTGA3′， 错义：5′GAATAAATAAGGCGCCTCAG3′。由武汉博士德公司合成。 1.2.2 Synphilin1、TH蛋白表达的定性检测 采用免疫组化法检测Synphilin1、TH蛋白表达。首先制备石蜡包埋切片，片厚5 μm,抗体购自Chemicon公司，严格按照试剂盒说明书操作，TH按1∶4 000稀释，Synphilin1按1∶3 000稀释，采用ABC法染色。每个标本在高倍镜（200倍）下观察，随机取3个视野，采用德国KONTRON IBAS 2.0 全自动图像分析系统，分别计数Synphilin1、TH阳性细胞数。 1.2.3 TH蛋白表达的半定量检测 采用icon公司。 1.2.4 TH mRNA表达的检测 采用原位杂交方法，地高辛标记的多项寡核苷酸探针及地高辛检测试剂盒均购于武汉博士德公司，TH原位杂交探针序列为：5′GTTTG AGACA TTTGA AGCCA AAATC CACCA3′(大鼠)；以杂交液中不加地高辛标记的探针作为阴性对照。严格按