TGFβ1基因转染对人晶状体上皮细胞周期调控的影响.docVIP

　　TGFβ1基因转染对人晶状体上皮细胞周期调控的影响 【摘要】 　　目的：探讨脂质体介导的TGFβ１基因（pEGFPTGFβ１）转染诱导人晶状体上皮细胞系B3(HLECB3)细胞周期蛋白激酶抑制因子p21及细胞周期蛋白激酶CDK2的表达及其对细胞周期调控的影响。方法：将pEGFPTGFβ１转染人晶状体上皮细胞系B3(HLEC B3)，采用RTPCR和: To investigate the change of p21,CDK2 and Smad4 on the HLEC transfected id and the effect of TGFβ１gene transfection on the cell cycle control of human lens epithelial cell. METHODS:Immortalized human lens epithelial cellline(HLEC B3) RNA,p21mRNA,CDK2mRNA and Smad4 mRNA and protein induced by transfered by TGFβ1 gene easured by RTPCR and EM培养液（美国Highclone公司）,胎牛血清（杭州四季青生物公司）, pSNAVTGFβ1，pEGFPC2质粒（北京本元正阳基因技术有限公司），Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）, Trizol试剂盒（GIBCO/BRL公司）; RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0（大连宝生物工程公司）;蛋白质免疫印迹化学发光试剂盒（德国Borhringer Mannheim公司）;鼠抗人CDK2及p21（NEB公司）;生物素标记的蛋白质标准样品,抗生物素标记的蛋白质标准二抗（美国NEB公司）。复苏时将冻存细胞系HLEC  B3从液氮罐中取出,快速放入37℃温水中溶解,溶化后以1200r/min离心约3～5min,离心半径为15cm。弃培养液后，放入含150mL/L胎牛血清、100mg/Ｌ青霉素及125mg/Ｌ链霉素的HGDMEM培养基中,置于50mL/L CO2，37℃的细胞培养箱内培养。EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pSNAVTGFβ1,回收插入片断（1.8kb），EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pEGFPC2,回收线性载体(4.7kb)，连接上述二种回收的DNA，转化,筛选克隆，构建后的质粒命名为pEGFP TGFβ1。 　　1.2　方法 　　转染前1ｄ将细胞接种至6孔板,细胞度为1×108个/Ｌ,在50mL/L CO2，37℃饱和湿度下培养24h,90%细胞达到融合;转染前使用PBS缓冲液冲洗细胞1次,更换不含抗生素的培养液。无血清HGDMEM250μL稀释pEGFP TGFβ14μg，温和摇匀。使用前轻轻混匀Lipofectamine2000，然后将Lipofectamine 2000 10μL加入无血清的HGDMEM 250μL，混匀并于室温温育5min。混合稀释的质粒和Lipofectamine 2000混匀，室温下放置20min。将质粒/Lipofectamine 2000复合物加入到6孔板的孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在50mL/L CO2，37℃饱和湿度下培养，6h后更换含150mL/L胎牛血清的HGDMEM培养基。将转染细胞,每日在倒置显微镜下观察并记录细胞的形态变化。实验分为pEGFPTGFβ1转染 24，48，72，96h组；pEGFPC2转染24，48，72，96h组；正常细胞对照组。提取总RNA,按照Trizol试剂盒说明书进行，参照Genebank的cDNA序列，用Primer Premier 5软件设计引物:TGFβ1:5 CTGTGGCTACTGGTGCTGAC 3;5CATAG ATTTCGTTGTGGGTTTC 3；p21:5CCCGTGAGCGATGGAA CT3;5CGAGGCACAAGGGTACAAGA3;CDK2：5CCGCCT GGACACTGAGACT3;5GAGGAGGACCCGATGAGA3;Smad 4：5CTGCCAACTTTCCCAACAT 3;5AGAAGGGTCCACGT ATCCA 3;PCR反应按下列组成配制PCR反应液：5×Pcr buffer10μL、灭菌蒸馏水28.75μL,TaKaRa Ex TaqHS 0.25μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL，将PCR反应液加入到反转录反应结束后的PCR反应管中按下列条件进行PCR反应：94℃预变性2min，94℃变性30s，50℃～65℃退火30s，72