β3GalT7基因转染HL60细胞及对其生物学行为的影响.docVIP

　　β3GalT7基因转染HL60细胞及对其生物学行为的影响 ：行书丽，岳爱环，唐春花，贾伟，吴士良] 【摘要】 　　目的： 初步探讨人类β1，3半乳糖基转移酶7（β3GalT7）基因对HL60细胞的细胞周期、侵袭能力等方面的影响。方法： 通过脂质体介导将本实验室构建好的β3GalT7真核正义表达载体pEGFPC1T7Sense和反义表达载体pEGFPC1T7AntiSense转染入HL60细胞；流式细胞仪分析各细胞株的细胞周期改变；Transids pEGFPC1T7Sense and pEGFPC1T7AntiSense into HL60 es.Cell cycle and invasive potential of the transfected cells etry and transid； antisense rebinant plasmid；cell cycle；invasive potential β1,3半乳糖基转移酶家族是糖基转移酶超家族中最具代表性的酶家族之一，β1,3半乳糖基转移酶7(beta1,3galactosyltransferase 7,β3GalT7)基因是我们实验室从人肺cDNA文库中克隆到的人类β3半乳糖基转移酶家族中的一个新成员［1,2］。 　　在此之前，β1,3半乳糖基转移酶家族已经克隆到6个成员(β3GalT1,T2,T3,T4,T5,T6)［3］。他们都以UDPαD半乳糖（UDPαGal）为供体基团，与之结合，把半乳糖（Gal）转移给受体底物，如各种不同的糖蛋白，糖胺聚糖，糖脂或激素等脂质小分子。研究显示，这些家族的许多成员可能与肿瘤的发生 发展 和浸润转移有关。在多种肿瘤细胞株中，β3GalT7都有不同程度的表达，而β3GalT7基因在急性粒细胞白血病细胞株HL60细胞中有中度表达。 　　为进一步阐明β3GalT7与肿瘤增殖和浸润转移的相关性，尤其是在恶性血液病中的作用，我们以HL60细胞株作为研究对象，分别特异性地上调及抑制β3GalT7基因在HL60细胞的表达，从而对其功能进行初步的研究。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 细胞 　　急性粒细胞白血病细胞株HL60购自上海生化细胞所。 　　1.1.2 主要试剂 　　小牛血清购自南京大治生物公司；1640完全培养基：每升RPMI1640基础培养基（Gibco,美国）中，添加小牛血清100 ml、L谷氨酰胺0.15 g，NaHCO3 2.0 g、葡萄糖3.6 g、HEPES(Amresco进口分装)4.7 g；胰蛋白酶购自Sigma公司；DEPC购自上海华舜生物工程公司；六碱基随机引物购自Invitrogen公司；Trizol，RNase Inhibitor，Superscript Ⅱ RNase H Reverse transcriptase购自Invitrogen公司；Taq DNA酶，dNTP MIX（10 mmol/L），10×PCR缓冲液，MgCl2(25 mmol/L)购自Promega公司；DNA 标准参照物购自南京大治公司;琼脂糖购自华美公司（Promega进口分装）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞转染 　　通过lipofectamine 2 000脂质体介导的方法将正义重组载体pEGFPC1T7Sense 和反义重组载体pEGFPC1T7AntiSense及空表达载体pEGFPC1分别转染急性粒细胞白血病HL60细胞，分别命名为HL60S,HL60AS及HL600。48 h后收集细胞，在荧光显微镜下观察转染后细胞。 　　1.2.2 β3GalT7 mRNA表达的RTPCR检测 　　分别收集处于生长对数期的细胞按 Trizol Reagent(Invitrogen公司) 操作手册提取总 RNA, 1%甲醛变性琼脂糖电泳检测 RNA完整性。取总 RNA 2 μg反转录为 cDNA第1链,再进行 PCR扩增。扩增产物以 2%的琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色,图像分析仪摄像并分析结果。设计引物采用Geyx软件,并经基因库Blast进行同源检索后合成。引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列为：正义链 5′CTATGTGCCCGAGTCCTTCTTCG3′(13241346 nt），反义链5′GCAGTTGTTTCCAGAGCCGAATG3′(16031625 nt)，预期扩增产物长度302 bp。PCR反应体系50 μl,反应条件: 95℃预变性 3 min, 95℃ 30 s, 56℃ 45 s, 72℃ 1 min,35个循环,72℃延长 10 min。 　　1.2.3 蛋白质印迹检