丹曲林钠对类缺血小鼠皮质神经元的［Ca2+］i和细胞活力的影响.docVIP

　　丹曲林钠对类缺血小鼠皮质神经元的［Ca2+］i和细胞活力的影响 ：高军宪，万琪，田晔，李力，刘勇红 【关键词】 ,钙离子 　　【Abstract】 AIM: To study the changes of intracellular ［Ca2+］ and cell activity in cortical neurons folloiclike conditioning and to explore the protective effects of dantrolene on the neurons. METHODS: Neurons easured by fluorescent intensity (FI) in each cell icroscopy and the degree of injured neurons in ischemiclike conditioning, a rapid increase in fluorescence intensity ic group and therapy group (Pgt;0.05). The A value of injured neurons in ischemic group iclike conditioning. 　　【Key; ischemiclike; dantrolene 　　【摘要】 目的： 观察类缺血后神经元内钙离子浓度及细胞活性的变化,探讨缺血性神经元的损伤与细胞内钙离子的关系及丹曲林钠（Dantrolene）的作用. 方法： 采用孕小鼠皮层神经元培养技术，应用相差显微镜观察培养的神经元形态，激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内钙离子浓度. 结果： 给予神经元类缺血处理5 min后,神经元内钙离子浓度与丹曲林钠组无显著差异(Pgt;0.05). 类缺血处理10 min后再灌注15 min细胞损伤程度较丹曲林钠干预组［Ca2+］i和MTT有显著性差异(Plt;0.01). 结论： 丹曲林钠可抑制神经元细胞内钙离子浓度的升高,降低缺血性神经元损伤的程度. 　　【关键词】 钙离子；类缺血；丹曲林钠 　　0引言 　　神经元对缺血、缺氧十分敏感，即使时间很短也会造成不可逆损伤，而这种损伤机制非常复杂，至今尚未阐明，但损伤后细胞内钙离子浓度升高是细胞损伤的重要原因， 细胞Ca2+信号转导异常被认为是神经细胞死亡的“最后共同通道”. 我们采用Flu3/AM为钙离子指示剂，参照Mitani等［1］法建立类缺血模型，采用激光扫描共聚焦技术［2］，监测缺血期间钙离子的变化并采用MTT比色试验观察缺血神经元的损伤情况，观察丹曲林钠（Dantrolene）的作用. 　　1材料和方法 　　1.1材料① 动物：孕15 d昆明种二级孕鼠(体质量100 g)由第四军医大学实验动物中心提供（陕动字003号）.② 主要试剂和仪器：胎牛血清由杭州四季青公司提供，DMEM由Gibco公司提供，胰酶由华美公司提供. CO2培养箱由Sanyo公司提供. 　　1.2方法 　　1.2.1激光扫描共聚焦显微镜专用培养皿的处理在直径60 mm塑料培养皿中央钻一直径10 mm的圆孔，将18 mm×18 mm盖玻片用加拿大胶粘于孔底部，消毒后使用. 　　1.2.2配制人工脑脊液其组成为（mmol#12539;L-1）：NaCl 123, KCl 3.75, KH2PO4 1.25, NaHCO3 26, MgCl2 1, CaCl2 2, 葡萄糖10，pH=7.4. 　　1.2.3细胞培养取孕15 d昆明种二级孕鼠，引臼脱颈处死,碘酒乙醇消毒腹部,逐层剖开腹部,取出胎鼠,仔细剥离胎膜羊膜,暴露胎鼠,体视显微镜下剥离脑膜,分离胎鼠大脑脑泡外侧部的皮质,剪碎脑组织,经1.25 g#12539;L-1的胰酶消化(37℃, 25 min),静置2~3 min 弃上清,200 g#12539;L-1胎牛血清的DMEM终止消化5~8 min,以完全培养基(100 mL#12539;L-1胎牛血清,青、链霉素1×1011 U#12539;L-1)稀释至7×108#12539;L-1密度并接种于经多聚赖氨酸(Sigma )处理过的专用培养皿和96孔板(细胞接种1×105/孔),送入含50 mL#12539;L-1 CO2和950 mL#12539;L-1 O2的培养箱(Sanyo公司), 37℃,培养48 h后,加入阿糖胞苷(5 mg#12539;L-1)以抑制非神经元的继续生长,每隔2 d半量换液,培养10 d后,可见典型的神经元细胞，经βtubulin免疫荧光染色显示80%以上细胞为阳性，可认为是纯神经元培养［3］. 　　1.2.4类缺血模型建立细胞培养基换为不含糖的人工