促肝细胞生长素对微小病变型肾病大鼠整合素连接激酶表达的影响.docVIP

　　促肝细胞生长素对微小病变型肾病大鼠整合素连接激酶表达的影响 ：张春江 贺德刚 段炜 陶林 杨晓萍 【摘要】 目的 观察促肝细胞生长素（Hepatocyte Grooting Factor，pHGF）对大鼠微小病变肾病(MCD)中整合素连接激酶（Intergrin Linked Kinase，ILK）表达的影响。方法 雄性SD大鼠72只，随机分为对照组、模型组、pHGF干预组各24只,一次性尾静脉注射阿霉素建立大鼠微小病变肾病模型，pHGF干预模型组于造模2周后腹腔注射pHGF30mg／kg,电镜观察大鼠肾小球足细胞形态学变化，免疫荧光观察各组大鼠在4周内肾小球足细胞中ILK表达情况。结果 ①电镜结果显示：模型组大鼠7天和14天足细胞广泛足突融合；pHGF干预模型组足细胞的足突变形、融合较模型组有所减轻；②与对照组相比，模型组大鼠肾小球ILK蛋白的表达7天减少，14天明显增加，差异有统计学意义（plt;0.05）；与模型组相比，pHGF干预模型组大鼠肾小球ILK蛋白的表达第21天出现减少，第28天达到最低值，差异有统计学意义（plt;0.05）；结论 ①ILK表达增加及分布异常，与足细胞病变密切相关，可能是判断肾小球足细胞损伤及导致蛋白尿原因的一个早期重要指标。②pHGF能抑制微小病变肾病大鼠肾小球ILK蛋白的表达，对MCD在肾脏结构及功能上既有保护作用又有 治疗 作用。 【关键词】阿霉素肾病 整合素连接激酶 促肝细胞生长素 肝细胞生长因子(hepatocyte grooting factor，pHGF)是从乳猪提取的相对分子质量10700左右的活性多肽，具有与HCF有相似的效用[1]。整合素连接激酶（integrin- linked kinase，ILK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞周期、基质积聚、肿瘤发生等中都起重要作用[2,3]。研究发现：ILK在微小病变肾病(minimal change disease,MCD)大鼠中表达的改变，可能直接或间接地影响了足细胞的功能状态[3,4]。然而，ILK表达的调控机制尚不清楚。本研究予促肝细胞生长素干预MCD大鼠肾小球足细胞，探讨pHGF对MCD大鼠肾小球足细胞ILK表达及肾脏组织病 理学 的影响。 1 材料和方法 1.1 主要试剂 阿霉素（深圳万乐药业有限公司）；兔抗ILK抗体（美国Santa Cruz）；罗丹明标记羊抗兔抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。促肝细胞生长素（南京南大制药有限公司,批号:。 1.2 动物模型的建立 清洁级雄性SD大鼠72只，体重180～220g，由新疆实验动物研究中心提供。将大鼠随机分为对照组、模型组、pHGF干预模型组各24只，后2组采用尾静脉注射阿霉素（浓度2mg/ml，7.5mg/kg剂量），建立MCD[6]，对照组尾静脉注射等体积生理盐水，观察28天，pHGF干预模型组于造模2周后腹腔注射pHGF，30mg/kg.d，共14天。 1.3 标本的收集及检测 分别于建模后第7、14、21、28天宰杀大鼠，每组各6只。大鼠处死前1天代谢笼收集24小时尿液，采用磺基水杨酸法测24小时尿蛋白定量；处死前动物麻醉通过内眦静脉采血，取血清测血浆白蛋白；留取大鼠肾脏进行病理检测。 1.4 肾脏病理检查 ①大体标本观察；②光镜观察：肾组织经10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE、PAS、Masson三色染色观察。③电镜观察：取约1mm3的肾皮质组织块，经2.5%戊二醛固定、1%锇酸后固定、脱水、环氧树脂618包埋，超薄切片后醋酸铀-柠檬酸铅染色，J EM1010透射电镜下观察。 1.5 肾小球ILK免疫荧光染色及定量分析 肾组织置液氮冰冻包埋，以3μm厚度在-20℃恒冷冰冻切片机连续切片，冻存于-20℃，37℃干燥，在4%多聚甲醛溶液中固定30min，PBS洗涤，10%正常山羊血清封闭1h，用一抗（抗ILK抗体）孵育（4℃过夜），PBS洗涤，再用罗丹明标记的抗-兔IgG二抗（37℃1h）孵育，PBS洗涤，DAPI封片。用PBS代替一抗作阴性对照。所有切片均在德国ZEISS公司ISM510型激光共聚焦扫描显微镜下进行单盲读片，每个标本均采集3个肾小球进行分析。用Zeiss LSM多功能真彩色图像分析系统测定肾小球中ILK的平均吸光度值作为各观察标本的表达量。若阳性信号分布均匀、连续，视为表达完整，ILK蛋白存在；若信号分布不均匀或节段消失，则视为表达部分缺失，ILK蛋白部分脱落。 1.6 统计学方法 观察指标以均数±标准差表示。运用SPSS13.0软件，对实验数据进行统计学处理。多组比较时，若方差齐则采用单因素方差分析；若方差不齐则采用秩和检验。相关分析采用S