哮喘鼠肺组织Notch1的表达及坎地沙坦的影响.docVIP

　　哮喘鼠肺组织Notch1的表达及坎地沙坦的影响 ：张连莲 赵 自然 张勇 于振香 【摘要】 　　目的 探讨Notch1信号途径与哮喘发生的关系，为哮喘的 治疗 提供理论依据。方法 建立BALB/C小鼠哮喘模型，实验分为对照组、哮喘模型组、坎地沙坦低剂量组和坎地沙坦高剂量组；HE染色观察各组肺组织病理改变，免疫组化法及免疫印迹法观察Notch1蛋白在各组肺组织中的表达变化。结果 HE染色可见哮喘模型组支气管黏膜存在不同程度的炎性改变，包括气道上皮的破坏、气道壁增厚、管壁黏膜下及周围炎性细胞浸润、肺泡扩张、支气管内分泌物储留；免疫组化法以及免疫印迹法显示模型组较正常对照组Notch1蛋白表达明显增加（Plt;0.001）；与模型组相比，坎地沙坦治疗组小鼠肺组织内Notch1蛋白水平明显下降（Plt;0.001）。结论 坎地沙坦可以明显改善哮喘引起的肺组织炎症，Notch1在哮喘发病机制中起一定作用，并可能与坎地沙坦引起的炎性改变存在一定的相关性。 【关键词】 哮喘；Notch1；坎地沙坦 　　支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞和肥大细胞等多种炎性细胞参与的呼吸道慢性炎症，其主要特征为气道高反应和黏液过分泌，是和遗传有关的速发型变态反应性呼吸系统疾病〔1～3〕。Notch信号途径在进化上高度保守，该途径通过相邻细胞间的受体配体相互作用而被激活〔4〕，已有研究证明Notch信号途径与哮喘发生之间存在一定关联〔5〕，但对两者之间相互作用关系的研究还不是很多。本研究建立了BALB/C小鼠哮喘模型，观察在哮喘改变时，肺组织中Notch信号通路分子Notch1表达水平的变化，同时应用血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂（ARB）坎地沙坦治疗，探讨其对哮喘的治疗作用及对Notch1表达的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物 　　BALB/C小鼠，雌性，6周龄，20只，由吉林大学医学动物繁育中心提供，体重18～22 g。Notch1与βactin抗体购自Santa Cruz公司。卵白蛋白购自Sigma公司，免疫组化试剂盒和二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司。 　　1.2 动物分组及模型建立 　　20只小鼠随机分为4组，每组5只，①对照组：正常饮食水；②哮喘模型组：腹腔注射混合液200 μl/只〔卵清白蛋白（OVA) 100 μg/只，氢氧化铝凝胶2.25 mg/只〕，0、7、14 d致敏。从第21天开始，连续7 d雾化吸入5%OVA 20～30 min。观察小鼠，若有烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、两便失禁等为阳性反应。③坎地沙坦低剂量组（坎地沙坦灌胃给药，2.5 mg/kg，连续7 d）。④坎地沙坦高剂量组（坎地沙坦灌胃给药，5.0 mg/kg，连续7 d）。 　　1.3 研究方法 　　各组小鼠以1%戊巴比妥腹腔注射麻醉处死，留取标本。摘取右肺置入液氮中冻存，左肺固定于4%多聚甲醛，48 h后常规脱水，石蜡包埋，切片(厚度为5 μm)。苏木素伊红（HE）染色，观察炎症细胞浸润。免疫组化法检测肺组织Notch1分布及变化。切片经常规脱蜡、水化后，用3%过氧化氢去除内源性氧化酶，抗原修复，余步骤按组化试剂盒说明书进行。用已知阳性片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照,Notch1抗体稀释浓度为1∶200。细胞质呈棕黄色着染者为阳性表达细胞。 　　1.4 免疫印迹法检测肺组织中Notch1蛋白的表达　 　　常规提取肺组织蛋白质，伯乐(BioRad)法定量，取60 μg样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)蛋白电泳。其后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，常规封闭，洗膜，一抗4℃过夜；第2天加入二抗，DAB显色。凝胶成像仪照相，测量灰度值。 　　1.5 统计学方法 　　采用SPSS11.0统计软件包处理，实验数据以x±s表示，目的蛋白电泳条带密度值用灰度×面积/参照物的比值表示。多组间比较用方差分析，两两比较采用t检验。 　　与正常对照组相比，模型组肺组织在肺泡壁上皮细胞和肺泡间质中可见多处棕黄色颗粒，而给予坎地沙坦 治疗 后，上述阳性颗粒表达明显减少，坎地沙坦高剂量组尤为明显。见图2。 　　2.3 哮喘肺组织Notch1蛋白的表达 　　与正常对照组相比，模型组Notch1蛋白表达水平明显升高（Plt;0.001），而坎地沙坦治疗后，Notch1蛋白的表达明显降低（Plt;0.001），见图3。 　　 　 　3 讨论 　　支气管哮喘是由多种炎症细胞、炎性介质及细胞因子参与的慢性炎症性气道疾病,其中CD4+T细胞发挥非常重要的作用，其激活是哮喘发病的主要环节〔6〕。CD4+T细胞可分为Th1和Th2两种类型，两者之间存在着动态平衡。研究表明Th1