生胃酮对大鼠颈动脉损伤后新生内膜过度增殖的影响.docVIP

　　生胃酮对大鼠颈动脉损伤后新生内膜过度增殖的影响 ：宋明宝，于学军，崔馨，陈剑飞，卢来春，赵刚，于世勇，董红梅，黄岚 【摘要】 目的：观察生胃酮对大鼠颈动脉损伤后新生内膜过度增殖的影响。方法：采用组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞， αactin免疫荧光染色阳性。50 μmol/L生胃酮处理平滑肌细胞24 h后对缝隙连接蛋白43的表达无影响(0.85±0.06 vs 0.83±0.03，n=3，Pgt;0.05)。球囊损伤大鼠颈动脉14 d后可见血管管腔狭窄、新生内膜增生明显。免疫荧光染色显示形成的新生内膜中缝隙连接蛋白43表达丰富。经生胃酮干预后新生内膜增生明显减轻，新生内膜细胞计数显著低于对照组 (89±28.40 vs 236±15.04，n=5，Plt;0.01)。结论:缝隙连接在血管损伤后新生内膜形成过程中扮演重要角色，而缝隙连接阻断剂生胃酮能抑制新生内膜过度增生。 【关键词】 新生内膜;血管;缝隙连接;生胃酮;大鼠 　　[Abstract] Objective: To observe the effect of carbenoxolone on neointimal hyperplasia after rat carotid balloon injury. Methods: Rat aortic SMCs (RASMCs) munofluorescence staining for SMαactin. The expression of Cx43 in RASMCs ol/L for 24 h odel of vascular injury als inistrated g/(kg·d)] in the carbenoxolone group or L/d) in the control group for 2 al formation of targeted vessels. And cell immunofluorescence staining munofluorescence staining for SM αactin. In this experiment, al formation and the stenosis of blood vessel lumen. EM/F12培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)及DAPI购于美国Gibco BRL公司;生胃酮及兔抗鼠平滑肌α肌动蛋白(SM αactin)单克隆抗体购于美国Sigma公司;羊抗缝隙连接蛋白43多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司; FITC标记的兔抗山羊IgG抗体购于北京中杉公司。 　　1.1.2 实验动物 SPF级SpragueDaL培养瓶中，在瓶口用眼科剪剪成约1.5 mm×1.5 mm大小的组织块，用吸管将组织块随机铺于瓶底，放入37 ℃、5%CO2的培养箱中贴壁4 h后加入含20% FBS及双抗的DMEM/F12培养基继续培养。以后每3 d更换培养液1次。采用抗SM αactin免疫荧光染色鉴定血管平滑肌细胞。 　　1.2.2 生胃酮对大鼠血管平滑肌细胞Cx43表达的影响 将培养的大鼠主动脉平滑肌细胞培养3 d后加入生胃酮使其终浓度为50 μmol/L，置37 ℃、5%CO2条件下继续培养24 h。未加18 αGA 预处理的细胞作为对照。收集细胞后经裂解液裂解，离心后取上清液，用Log/kg)腹腔麻醉。取颈部正中切口，颈外静脉注射肝素钠100 U/kg。无菌条件下游离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，暂时阻断颈总动脉近心端及颈外动脉血流，结扎颈内动脉远心端，用眼科剪在结扎点旁距颈内动脉分叉点约3 mm处剪开动脉，将1.5 F的Fogarty球囊导管从切口处插入颈总动脉约1.5 cm，1.5大气压充盈球囊，使球囊刚好能在血管中拉动，在远心端缓慢回拉球囊至颈内、颈外动脉分叉处，重复拉动3次，每次间隔2 min，间隔期球囊处于充盈状态，以使损伤区缺血缺氧。结扎颈内动脉分叉处，常规缝合皮下组织和皮肤。14 d后处死动物，取出病变血管及对侧正常血管，OCT包埋后行冰冻切片，经冷丙酮固定5 min后进行HE染色以观察新生内膜形成情况。 　　1.2.4 血管损伤后形成的新生内膜中Cx43表达的检测 14 d后处死动物。步骤简述如下：(1) PBS漂洗1次;(2)0.3%TritonX100室温下孵育10 min;(3) PBS洗涤5 min×3次;(4) 10%正常兔封闭血清37 ℃孵育20 min;(5) 吸弃封闭血清，滴加羊抗Cx43多克隆抗体(1∶100)稀释，阴性对照组用PBS替代一抗，置于湿盒中4 ℃冰箱过夜;(6)PBS洗涤5 min×3次;(7)滴加FITC标记兔抗羊