电针内关对心肌缺血再灌注损伤大鼠NO、NOS与baX的影响.docVIP

　　电针内关对心肌缺血再灌注损伤大鼠NO、NOS与baX的影响 ：王超严洁田岳凤杨效芳林亚平 【摘要】目的观察电针内关穴对大鼠心肌缺血再灌注损伤的NO、NOS与baX的影响。方法在鼠冠状动脉左前降支根部穿线置一硅管结扎左前降支，制作心肌缺血再灌注损伤，检测大鼠NO、NOS与baX的水平。结果模型组心肌总NOS活性显著低于假手术组（P＜0.05），电针内关组心肌总NOS活性显著高于模型组（P＜0.01）及电针列缺组和电针合谷组（均为P＜0.01），电针列缺组和电针合谷组心肌总NOS活性与模型组比较虽有升高，但差异无显著性意义（P＞0.05），表明电针内关可使心肌局部NOS活性升高。 NO和NOS在心肌缺血再灌注中起着重要的作用[1]。NO是一种生物活性分子，主要由血管内皮细胞（VEC）合成，通过增加细胞内的环磷酸鸟苷（CGMP）而发挥广泛的生物作用。NO不仅参与了对冠脉血管舒缩的调控，维持有效的冠脉循环血流，而且对缺血后心肌的转归及心肌功能的恢复可能起着重要的作用，当心肌发生MIRI损伤时，明确缺血心肌处NO变化 规律 及NO对心肌功能的影响有着重要的临床意义。NOS为一含铁的单氧化酶，主要分布于血管内皮细胞、N细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等细胞内，可催化左旋精氨酸转化为瓜氨酸和NO[2]。心肌组织内的NOS同功酶有两种：原生型（cNOS）和诱生型（iNOS），cNOS主要由血管内皮细胞产生；iNOS主要产生于巨噬细胞中[3]。baX是bcl-2家庭中的一员，起着促进细胞调节的作用[4]，采用免疫组织化学方法来分析调节细胞基因的表达已受到人们的高度重视，并被广泛应用于科研及临床研究中。近年来大量实验和临床研究均证实，针刺心包经内关穴对缺血心肌具有明显的保护作用，而降低缺血再灌注损伤程度，有效保护心肌也一直是国内外医学界十分关注的课题。本项研究通过观察电针内关对心肌缺血再灌注损伤大鼠NO、NOS及凋亡调控基因baX的影响，试图阐明电针内关抑制心肌缺血再灌注损伤的作用机制。 1材料与方法 1.1动物与分组 l/100g）腹腔注射麻醉，行插管，接动物人工呼吸机，于第三、四肋间隙处开胸，暴露心脏，冠心动脉左前降支根部穿零号医用缝合线，心电图监测，穿线处置一硅胶管结扎左前降支，以左室前壁发绀并向外膨胀及心电图及S-T段抬高为标志，关闭胸腔，40min后开胸，剪开硅胶管，恢复左前降支灌流，60min后，取静脉血，摘取心脏。 假手术组：冠状动脉左前降支根部穿线后，心电图监测，记录120min内心电图S-T段变化，取静脉血，摘取心脏。缺血再灌注模型组：左冠状动脉前降支根部穿线后，心电图监测，结扎左前降支40min，再灌注60min后，取静脉血，摘取心脏。电针内关治疗组、电针列缺对照组、电针合谷对照组：冠状动脉左前降支根部穿线后，心电图监测，关闭心电图机，电针穴位20min，去电针，心电图监测，结扎左前降支40min，电针穴位20min，再灌注60min后，取静脉血，摘取心脏。 1.3针刺方法 “内关”和“合谷”穴定位参照《 中国 针灸汇萃#8226;兽医针灸卷》标准穴位图谱；“列缺”穴定位采取拟人比照法，电针用G6805电针仪，疏密波刺激（疏波30Hz，密波100Hz），强度6-15V，进针深度0.5cm左右，针刺“内关”、“合谷”、“列缺”组均将负极接两侧穴位，正极接鼠尾，以前肢出现轻微颤动为度。 1.4观察指标与检测方法 1.4.1心肌一氧化氮（NO）检测摘取心脏，置于冰冷的生理盐水中冲洗，除去血液，滤纸拭干，分析天平称取0.2g心肌组织，放入小烧杯内，用刻度吸管加入组织块重量9倍的生理盐水，眼科小剪剪碎组织块，倒入玻璃匀浆管中，置于匀浆机上，捣杆垂直插入管中，上下转动研磨40-50次，制备成10%的组织匀浆液，倒入离心管中，350rpm常温离心15min，取10%心肌组织匀浆上清液0.5ml，按一氧化氮试剂盒检测步骤，用754紫外分光光度计测定。 1.4.2心肌一氧化氮合酶（NOS）活性检测取组织匀浆上清液100ul，加入底物缓冲液200ul，促进剂10ul，显色剂100ul，37℃水浴准确反应15min，加入透明剂100ul，终止液2000ul，混匀。754紫外分光光度计，蒸馏水调零，530nm处，1cm光径比色测吸度A值，以双缩脲法测定其组织蛋白含量。 1.4.3baX蛋白含量测定采用免疫组化测定，动物再灌注60min后，摘取心脏，取结扎下方左心室肌，大小1cm×0.8cm×0.3cm，10%中性福尔马林固定，经处理制成蜡切片，PBS冲洗，加过氧化酶阻断溶液，室温孵育，PBS冲洗，抗原修复，加第一、第二抗体，镜下观察，苏木素复染，常规分化（脱水、透明、中性树胶封片，试剂盒均由福建迈新生物技术开发公司提供）。 1