洗脱流速.PPT

研究背景 研究现状——多肽配基设计 原理：乳糖操纵子DNA域（lacO）→乳糖阻遏蛋白（LacI） LacI为DNA结合蛋白，结合域包括螺旋Ⅰ（6-12），转角，螺旋Ⅱ（17-25），螺旋Ⅲ（32-45），螺旋Ⅳ（50-58）。其中螺旋Ⅰ和螺旋Ⅱ形成HTH结构。 LacI几乎不与RNA反应，固定化后依然具有生物活性 分子模拟现状 LacI通过与LacO特异性结合控制着乳糖代谢，与操纵子结合部位可分为O1、O2、O3三个部分。这三个部分功能不同，以O1为主，O2、O3为辅。最为重要的是中心的17对碱基对，以中间的G:C为中心形成伪倒序结构 。 LacI-LacO结合部位的磁核共振建模已经成熟，有现成的对接模型 有研究者采用对比方法，比较了LacI头分别与O1、O2、O3的反应，发现与O1、O2都表现出良好的亲和性，而与O3形成额外的复合物，这可能与非特异性吸附有关。 有研究表明其中C端残基Arg50-Gly58形成枢纽区域。 研究的目的及意义 研究意义： 目前依然处于多肽配基研究的早期阶段，实验中常常套用蛋白分离的技术方法。虽然蛋白短肽配基已有所发展，但是质粒由于分子量大，空间位阻较大，作用更为复杂； 多肽配基的合成成本高昂，肽链长度直接决定了合成成本，短肽一般6-8残基，成本将明显下降； 亲合作用复杂，配基的寻找困难，而采用分子动力学模拟的方法将实验以模拟的形式进行，能大大减少实验量筛选出合适的配基。 研究目标： 设计寻找合适的短肽配基，摸索其吸附洗脱的条件， 验证配基稳定性，分离sc质粒获得高回收率和纯度。 pDNA粗液的制备 pDNA自主复制：可采用质粒pUC19(0.01 lg/l, Invitrogen)转化大肠杆菌DH5α（此处可用其他现有质粒代替，只要含Lac操纵子即可），取50μL菌液放入50mL LB培养基中培养24h，温度保持37℃。活化后的菌株再依比例放大到500ml或1L培养基中。 pDNA的提纯：制备质粒粗液收集500mL菌液至大离心管中，冷冻离心，4℃，4800rpm离心15min，弃上清。将沉淀重溶于18mL溶液I中。加入40mL新配置的溶液II，室温放置10min。加入20mL用冰预冷的溶液Ⅲ，缓缓颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，4℃冰箱放置10min。3047转头，4℃，4800rpm离心15min。将上清移至新离心管中，再次3047转头，4℃，4800rpm离心15min，重复操作两次。将上清过滤(用滤纸和漏斗)至新离心管中，加0.6倍体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min。3047转头，室温下，4800rpm离心15min。弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，#3047转头，室温下，4800rpm离心15min。3mLTE溶解沉淀，转移至40mL小离心管中。 采用promega公司质粒提取试剂盒和聚乙二醇纯化法制备质粒纯品。 配基选择 配基的筛选：参考文献（Specificity and affinity of Lac repressor for the auxiliary operators O2 and O3 are explained by the structures of their protein-DNA complexes）所构造的LacI-LacO结合模型，通过rosetta软件进行分子动力学模拟。通过公司合成此配基，进行下一步实验。 配基连接：可采用商品化介质或实验室现有介质，，配基的合成包括了乙酰化以保证标准长度肽的N端包含Cys残基，因为Cys残基中的硫醇基能通过共轭作用来控制配基的固定化的方向。过程中可加入5%（体积）DMSO，能够增加小分子配基的溶解性能。 静态吸附试验 洗脱实验 稳定性——短肽稳定性实验 稳定性——介质连接稳定性实验 扩展内容 与实验室现有介质 用实验室的介质如磁性介质或凝胶球，形成磁化床或制造整体住 直接分离裂解液 细胞破碎后的裂解液含大量杂质（宿主DNA、RNA、宿主蛋白、细胞壁物质、内毒素等），蛋白配基能够已成功处理了裂解液，而氨基酸配基由于特异性不强，无法直接处理。 短肽配基有比氨基酸更强的选择性，可尝试用之前实验