苦瓜MAP30基因的克隆表达及对BGC823细胞形态的影响.docVIP

　　苦瓜MAP30基因的克隆表达及对BGC823细胞形态的影响 ：黄河 邵世和, 韩晓红, 田树伟 韩军1, 黄世腾 【摘要】 目的： 克隆苦瓜蛋白MAP30基因,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,初步研究MAP30蛋白对BGC823细胞的影响。方法: 应用PCR技术从苦瓜基因组中扩增出MAP30基因片段,将其TA克隆和双酶切鉴定,再进行测序分析,并构建重组表达载体pET28aMAP30,转化到表达菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,用 NTANi2+ 树脂分离纯化所表达的 MAP30 融合蛋白,并经 SDSPAGE 电泳鉴定;纯化的蛋白作用于 BGC823 细胞后通过光镜和电镜进行形态学观察。 结果: 成功扩增出MAP30基因为861 bp, 与基因库中公布的DQ643967同源性为100%,与DQ643968和S79450的同源性为99%;成功构建 pET28aMAP30原核表达重组质粒;通过NTANi2+树脂分离纯化目的蛋白,获得原核表达的大小约为30 000的MAP30融合蛋白,与预测一致;蛋白作用细胞后,细胞形态有明显变化。结论: 成功构建pET28aMAP30表达载体并获得原核表达的MAP30融合蛋白;重组MAP30蛋白能引起BGC823细胞明显的形态学变化。 【关键词】 苦瓜; MAP30; 克隆; BGC823细胞; 凋亡; 电镜 　　[Abstract] Objective: To clone the MAP30 gene and to express it in E.coli BL21(DE3) and to detect the influence of the MAP30 protein on proliferation in BGC823 cells. Methods:Polymerase chain reaction(PCR) plify the MAP30 gene from bitter guard genome DNA. Then the target gene ed into E.coli DH5α and identified by restriction digestion and DNA sequencing. Then the MAP30 gene fragment ed into E.coli BL21. The hisMAP30 fusion protein n and identified by SDSPAGE. The morphological change of cell icroscope and the electron microscope. Results: DNA sequence analysis shoology ed into E.coli BL21.The fusion protein mol/L IPTG induction for 5 hours. The protein n olecular orphological changes. Conclusions:The prokaryotic expression vector pET28aMAP30 E.coli BL21.The rebinant MAP30 protein can cause the morphological change of BGC823 cells significantly. 　　[Key ordica charantia(MC); MAP30; cloning; BGC823 cell; apoptosis; scanning electron microscope(SEM) 　　苦瓜属于葫芦科植物,主要分布于热带和亚热带地区,含有很多活性成分,其中包括一种核糖体失活蛋白MAP30。MAP30是含有263个氨基酸的单链蛋白,具有抗HIV、抗肿瘤[1]和抗菌活性[2],经过限制性蛋白水解后的片段仍具有这些活性[3],而且,重组蛋白具有与天然蛋白相同的功能和活性[2]。国外已经利用pRSET原核载体和ZYMVAGII病毒载体在相应的表达体系中对MAP30基因进行表达,获得的重组MAP30蛋白同样具有抗病毒、抗肿瘤和抗菌活性[2]。国内对于重组MAP30蛋白做了很多研究,甚至对不同苦瓜品种的MAP30基因进行克隆及序列分析[4]。最近研究表明,重组MAP30在体外还能抑制乙型肝炎病毒复制[5]。本文通过MAP30基因的克隆和生物信息学分析,构建原核表达载体,表达MAP30重组蛋白,并研究了重组MAP30蛋白对BGC823细胞形态的影响。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材 料 　　1.1.1 菌种及载