选择性环氧合酶2抑制剂NS398对肝星状细胞凋亡的影响.docVIP

　　选择性环氧合酶2抑制剂NS398对肝星状细胞凋亡的影响 【摘要】 目的: 观察选择性环氧合酶2抑制剂NS398对肝星状细胞（HSC）凋亡及凋亡相关基因的影响。方法: 采用不同浓度的NS398作用于HSCT6, 应用流式细胞术和透射电镜检测HSC凋亡, 细胞免疫化学法检测凋亡HSC中凋亡相关基因p53、 bcl2蛋白表达的变化。结果: 90、 120、 150 μmol/L NS398作用HSCT648 h后, 流式细胞术检测到HSC凋亡, 各组凋亡指数分别为（10.5±0.015）%、 （13.2±0.010）%和（17.3±0.012）%, 与对照组(4.3±0.006)%比较, 差异有统计学意义（Plt;0.01）; 透射电镜观察到细胞皱缩、 核染色质浓缩沿核膜排列等细胞凋亡特征性改变; 以120 μmol/L NS398作用HSCT648 h后, 凋亡相关蛋白p53、 bcl2的阳性细胞百分率分别为（82.06±0.14）%、 （34.20±0.77）%, 与对照组（14.06±0.24）%、 （96.66±0.79）%比较, 差异有统计学意义（Plt;0.01）。结论: NS398可以剂量依赖性诱导HSC凋亡; 上调凋亡相关基因p53的表达, 下调bcl2的表达可能是NS398诱导HSC凋亡的机制之一。 【关键词】 环氧合酶2 NS398 肝星状细胞 细胞凋亡 　　肝星状细胞( hepatic stellate cell, HSC) 在肝纤维化的发生 发展 中具有重要作用, HSC增殖与凋亡的失平衡是肝纤维化发生发展的主要细胞生物学基础, 在肝纤维化的发生发展中起重要作用, 诱导其凋亡是 治疗 肝纤维化的重要策略。有观察显示HSC中有选择性环氧合酶2（cyclooxgenase2, COX2）基因的表达, 而且其表达与HSC的增殖有关［1］。我们前期的研究已证实选择性环氧合酶2抑制剂NS398可以确切地抑制HSC增殖［2］。本实验拟进一步观察NS398诱导HSC凋亡的作用及其可能的分子机制, 以探索临床抗肝纤维化的新途径。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 肝星状细胞系（HSCT6）, 由上海中医药大学徐列明教授提供, 系SV40转染的大鼠HSC, 具有活化HSC的表型; NS398为美国Cayman公司产品; DMEM培养液、 新生牛血清分别购自美国Gibco及Hyclone公司; AnnexinⅤFITC及PI购自美国罗氏公司; 小鼠抗大鼠bcl2单克隆抗体(mAb)购自美国Santa Cruz公司; 兔抗大鼠野生型p53多克隆抗体购自武汉博士德公司; 即用型第2代免疫组化EliVisionplus广谱试剂盒和DAB显色试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 NS398贮存液的配制 以少量DMSO溶解, 加入无血清DMEM配制成800 μmol/L的贮存液, 0.22 μm微孔滤器过滤除菌, 分装, 避光存于-20℃保存, 2周内有效。使用时用含20 mL/L血清的DMEM培养液稀释至所需的药物浓度, DMSO的终浓度要求低于1‰, 细胞对照组加入相同浓度的DMSO, 以排除DMSO对细胞生长的影响。 　　1.2.2 HSCT6的培养与传代 采用含100 U/mL青霉素、 100 U/mL链霉素、 100 mL/L新生牛血清的DMEM培养液, 在37℃、 50 mL/L CO2及饱和湿度下培养, 隔日换培养液, 待细胞生长至80%～90%密度时, 用0.2 g/L EDTA和2.5 g/L胰蛋白酶消化, 按1∶4比例传代。 　　1.2.3 药物细胞毒性试验 倒置显微镜下观察HSCT6形态。NS398对HSCT6的细胞毒性:取对数生长期细胞, 调整细胞密度为7.5×107/L, 细胞接种于96孔培养板中, 每孔200 μL, 24 h后弃上清, 加入含不同浓度的NS398（0、 5、 20、 40、 80、 120、 160、 240、 320 μmol/L）培养液, 每孔200 μL, 每组设4个复孔, 培养48 h后, 收集培养液上清, 全自动生化分析仪检测上清中LDH水平。 　　1.2.4 细胞凋亡检测 流式细胞术检测: 取对数生长期细胞, 以1.2×106/瓶的密度接种于T25培养瓶中, 24 h后加入各浓度NS398（0、 90、 120、 150 μmol/L）培养48 h, 收集所有细胞, 取1×106洗涤细胞, 加100 μL结合缓冲液, 并加AnnexinVFITC染液和碘化丙啶（PI）染液各2 μL, 室温避光染色30 min, 再加结合缓冲液300 μL, 以流式细胞术检