实验 13酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)之转型作用(Transformation).pdfVIP

實驗 13 酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)之轉型作用 (Transformation) 概述 生化技術上酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)是一種很有用的真核生物，由 於其擁有生物的特性，且可用原核生物的方式培養。同時，酵母菌的基因組很小 複製時間(doubling time)又短，又可作基因分析，所以分子生物學研究上的突破 有很多都是以它為材料所做出的。在工業上酵母菌也很重要，如啤酒、麵包、酒、 重組肽和蛋白質之合成皆與酵母菌有關。 較進步的重組DNA 技術中，酵母菌乃是一種很重要的寄主生物，可用質體 DNA 為媒介物，引入外來DNA 而表現之(Botstein Hnk,1988) 。轉型技術與大 腸桿菌(E.coli)所用的相似，但方法須修飾配合以瓦解其細胞壁。通常以下列二種 方式之一來進行酵母菌的轉型作用，形成spheroplasts ，包括把細胞壁去掉(Hinnen et al.1978)或用鹹性陰離子快速地處理完整的細胞(Ito et al.,1983) 。在此我們利用 後者以獲取大量的轉型細胞。 收集生長對數期的酵母菌細胞，而後經鹼性陰離子(i.e.LiCl 或 RbCl) ，熱休 克及polyalcohol 處理，就可使細胞外鞘發生變化而有利於吸取質體，正如E.coli 不同的因子皆會影響轉型效率。見實驗 14 之概述部分。但質體吸收能力與質體 大小，DNA 構形及寄主品系和篩選步驟有關，而利用某些質體進行酵母菌的轉 3 4 型作用每 1mg 質體DNA 可獲取 10 -10 轉型細胞。 本課程中所採用的 pRYl21 質體，是一種很好用的材料。它是一種往返載體 (shuttle vector) ，可在大腸桿菌(Ecoli)和酵母菌中複製，而且含有β-半乳糖脢( β -galactosidase)之編碼。β-galactosidase 蛋白可用一種很簡單的偵測方法偵測之， 而該蛋白質之表現與基本調節因子GAL 散動子有關。實驗 10 有質體pRY121 之 詳細介紹。 136 試劑/工具 名 稱 規 格 數 量 無菌的離心管 50ml 數個 無菌的離心管 1.5ml 數個 LiCl/TE 溶液 (100mM LiCl 溶於 一瓶 TE buffer 溶液中) PEG(Polyethylene glycol) 一瓶 酵母菌(Saccharomyces cerevisiae) 一瓶 己二烯 一瓶 TE 緩衝液 一瓶 無菌的離心管50ml 無菌的離心管 1.5ml LiC TE buffer 137 PEG(Polyethylene glycol) 酵母菌 儀器 名 稱 規 格