半胱氨酰白三烯受体2多克隆抗体制备及其鉴定.docVIP

　　半胱氨酰白三烯受体2多克隆抗体制备及其鉴定 　　半胱氨酰白三烯受体包括CysLTkCysLT2和GPR17三种亚型其中，对CysLT受体了解得较多，且有较多选择性拮抗剂，而对CysLT2受体相对了解得较少[㈩；GPR17为新近鉴定的亚型，有待深入研究CysLT2受体分布在脉脾脏、淋巴结、脑、肾脏小肠皮肤脐静脉内皮细胞、支气管和冠脉平滑肌细胞血液单核细胞和巨噬细胞、肥大细胞等;其效应包括激活血管内皮细胞和巨噬细胞促进肥大细胞释放IL~8等细胞因子、促进肺纤维化等。本实验室最近发现，CysLT2受体介导星形胶质细胞缺血损伤;并且，发现大鼠胶质瘤C6细胞主要表达CysLT2受体这些结果为进一步研究该受体亚型的调节作用奠定了基础。 　　但是，有两个因素限制CysLT2受体研究的深入，一是缺乏选择性拮抗剂，二是缺乏对动物的特异性抗体，仅有针对人的商品化抗体。为此，除了筛选CysLT2受体拮抗剂外，本研究在制备另一种CysLT受体GPR17抗体的基础上[8]，制备兔抗大鼠CysLT2受体抗体，并研究其在icro?plateRecorder,美国Bio-TEK公司）；SDS胶电泳转膜装置（美国BIO-RAD公司）；ODYSSEY免疫印迹膜荧光成像系统（美国LI~CORBiosciences公司）；冰冻切片机(CM1900,德国Leica公司）；荧光显微镜(BX51,日本Olympus公司) 　　1.2实验动物雄性家兔3只，体重25~3kg,购自浙江大学动物中心;成年雄性昆明种小鼠和SD大鼠各5只，购自浙江省医学科学院试验动物中心(合格证号：2008!) 　　1.3CysLT2受体多克隆抗体制备KLH-CysLT2受体多肽抗原以生理盐水稀释成2mg/ml,与等体积的弗氏佐剂以三通管推注法乳化30min,将少量乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，呈滴状浮于水面，即乳化完全，可用于家兔免疫。 　　多肽(cg)FAGENFKARLRAIFSKDHL(大在家兔背部脊柱两侧、颈部皮肤’多点皮下 　　注射乳化抗原共1ml只。首次注射抗原-完全佐剂免疫，以后每隔10d,以同样方法用抗原不完全佐剂加强免疫，共6次,最后一次免疫后5天，兔耳缘静脉采血1ml,分离血清，以双向琼脂免疫扩散鉴定血清的抗体效价。最后一次免疫后10d,以20%乌拉坦麻醉，颈动脉插管，收集血液，分离血清,按需要加入叠氮钠至0.02%;然后分装血清，于-20C~-70C保存 　　1.4抗血清的免疫学特性鉴定 　　1.4.1双向琼脂免疫扩散在1%琼脂糖凝胶上打梅花孔，中孔加入10KLH-CysLT2受体多肽，周围孔加10l1/11/21/41/81/16 　　1/32稀释的兔血清,37C湿盒内温育24h后观察，如中孔与周围孔之间出现白色沉淀线，则为阳性 　　1.4.2效价测定采用间接ELISA法测定，采用研究组先前报道的方法[8]用抗原（KLH-CysLT2受体多肽)包被酶标板(预实验确定包被抗原浓度为1g/ml),4C湿盒内过夜,洗板后加入倍比稀释（1/8~1/1047296)的待测兔血清，37°C湿盒内孵育2h洗板后，加入HRP标记的羊抗兔IgG(1/10000)2h,再加入底物溶液孵育10~30min,加中止液后于酶标仪490nm波长处测光密度同时，设立空白对照和阴性对照 　　1.4.3特异性鉴定以ELISA法，测定可溶性抗原（KLH-CysLT2受体多肽）阻断兔血清抗体反应，以50%最大抑制浓度（IG。)作为敏感性指标为检测抗体与其他受体的交叉性，用KLH偶联的CysLTi受体和GPR17多肽作为抑制剂，以ELISA法测定各种多肽抑制抗体的反应，判断抗血清与CysLTi受体和GPR17有无交叉反应 　　1.5CysLT2受体表达的鉴定 　　1.5.1g/ml；单用偶联蛋白KLH以及KLH-CysLTi受体KLHGPR17多肽，则无明显阻断作用，无法计算其IC5()(图2) 　　2.4组织样本中CysLT2受体的表达用RNA表达，发现脑、肾脏和肺均有表达，小鼠肺的表达较弱（图3D) 　　2.5大鼠脑内CysLT2受体的表达和分布免疫组化检测中，用制备的抗体（1：1000)检测CysLT2受体蛋白在大鼠脑内的表达和分布，结果显示，该受体主要表达在皮层和海马NeuN阳性的神经元，也表达在部分GFAP阳性的星 　　KLHgt;CysLT2受体多肽、KLH~GPR17多肽及KLH对抗体活性无阻断作用。 　　图2多肽抗原对CysLT2受体抗血清抗体活性的阻断作用Fig.2BlockingeffectsofpolypeptideantigensonantibodyactivityofCysLT2receptorantiserum 　　形胶质细胞(图4) 　　3讨论 　　本研究制备了家兔抗大鼠